Seguimiento del tráfico de células T inducido por anticuerpos biespecíficos utilizando células T humanas transducidas por luciferasa

Resumen

Aquí, describimos un método para transducir células T humanas con luciferasa para facilitar el seguimiento in vivo del tráfico de células T inducido por anticuerpos biespecíficos a tumores en estudios para evaluar la eficacia antitumoral y el mecanismo de anticuerpos biespecíficos que involucran a las células T.

Resumen

Los anticuerpos biespecíficos que se involucran con células T (T-BSABS) se encuentran en varias etapas de desarrollo preclínico y pruebas clínicas para tumores sólidos. Factores como la valencia, la disposición espacial, la distancia entre dominios y las mutaciones Fc afectan la eficacia antitumoral de estas terapias, comúnmente al influir en la orientación de las células T a los tumores, lo que sigue siendo un desafío importante. Aquí, describimos un método para transducir células T humanas activadas con luciferasa, lo que permite el seguimiento in vivo de las células T durante los estudios de terapia T-BsAb. La capacidad de los T-BsAbs para redirigir las células T a los tumores se puede evaluar cuantitativamente en múltiples puntos temporales durante el tratamiento, lo que permite a los investigadores correlacionar la eficacia antitumoral de los T-BsAbs y otras intervenciones con la persistencia de las células T en los tumores. Este método alivia la necesidad de sacrificar animales durante el tratamiento para evaluar histológicamente la infiltración de células T y puede repetirse en múltiples puntos de tiempo para determinar la cinética del tráfico de células T durante y después del tratamiento.

Introducción

Los anticuerpos biespecíficos que se involucran con células T (T-BsAbs) son anticuerpos diseñados que se usan para proporcionar especificidad artificial a las células T policlonales al involucrar a las células T a través de un brazo de unión y un antígeno tumoral a través de otro brazo de unión. Esta tecnología se ha aplicado con éxito a cánceres hematológicos (blinatumomab¹ dirigido a CD19), y numerosos T-BsAbs están en desarrollo preclínico y clínico para una variedad de tumores sólidos también². Los T-BsAbs involucran a las células T policlonales de una manera independiente del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y, por lo tanto, incluso los tumores que regulan negativamente los antígenos leucocitarios humanos (HLA) son susceptibles a este tipo de terapia ^3,4. Los T-BsAbs se han desarrollado en docenas de formatos diferentes, con diferencias en la valencia y disposición espacial de los brazos de unión de células T y tumores, distancias entre dominios y la inclusión de un dominio Fc, que afecta la vida media y puede inducir funciones efectoras si están presentes⁵. Trabajos previos en nuestro laboratorio han demostrado que estos factores afectan significativamente la eficacia antitumoral de T-BsAbs, con diferencias de hasta 1.000 veces en la potencia⁶. A través de este trabajo, identificamos el formato IgG-[L]-scFv como la plataforma ideal para T-BsAbs (consulte la sección Resultados representativos para obtener más detalles sobre los formatos T-BsAb), y hemos aplicado esta plataforma a objetivos que incluyen GD2 (neuroblastoma), HER2 (cáncer de mama y osteosarcoma), GPA33 (cáncer colorrectal), STEAP1 (sarcoma de Ewing), CD19 (neoplasias malignas de células B) y CD33 (neoplasias malignas de células B)^7, 8,9,10,11,12,13.

Uno de los principales desafíos para implementar con éxito la terapia T-BsAb en tumores sólidos es superar un microambiente tumoral inmunosupresor (TME) para conducir el tráfico de células T a los tumores¹⁴. Los factores que afectan la eficacia de T-BsAb descritos anteriormente tienen un impacto significativo en la capacidad de T-BsAbs para inducir eficazmente la orientación de células T a los tumores, pero este efecto es difícil de evaluar en un sistema in vivo en tiempo real. Este manuscrito proporciona una descripción detallada del uso de células T transducidas por luciferasa en estudios preclínicos de T-BsAbs para evaluar el tráfico de células T a diversos tejidos en modelos experimentales de ratones inmunocomprometidos durante el tratamiento. El objetivo general de este método es proporcionar un medio para evaluar la infiltración de células T en tumores y otros tejidos, así como información en tiempo real sobre la cinética y persistencia de las células T, sin la necesidad de sacrificar animales durante el tratamiento. Para el creciente número de investigadores que se centran en las inmunoterapias celulares, la capacidad de rastrear las células T in vivo en modelos animales preclínicos es crucial. Nuestro objetivo es proporcionar una descripción exhaustiva y detallada del método que hemos empleado para rastrear las células T transducidas por luciferasa para permitir que otros investigadores puedan replicar fácilmente esta técnica.

Protocolo

Los siguientes procedimientos han sido evaluados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Memorial Sloan Kettering.

1. Transfección de células 293T con luciferasa y recolección de sobrenadante viral

1. Cultivo de células 293T
   1. Prepare los medios agregando lo siguiente a un litro de DMEM cada uno: 110 ml de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 11 ml de penicilina-estreptomicina.
   2. Descongelar 5 x 10⁶ 293T y transferirlas a un matraz T175 con el medio preparado como se ha descrito anteriormente.
   3. Divida las células 293T 1:10 cada 3 días durante 6 días. No permita que las células se vuelvan más del 90% confluentes.
2. Transfección de células 293T
   NOTA: Se calculan las siguientes cantidades de reactivos para transfectar un matraz T175 de células 293T. Ajustar en consecuencia si se van a transducir más matrazs.
   1. Transfiera 1,5 ml de medio a cada uno de los dos tubos de 50 ml utilizando una pipeta. A un tubo, agregue 10 μg de plásmido VSV-G, 20 μg de Gag/pol y 20 μg de plásmido luciferasa de tomate rojo TD (CBR-TDR) y mezcle. Al otro tubo, añadir 100 μL de ADN in vitro reactivo de transfección y mezclar. Incubar ambos tubos a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
      NOTA: Todos los plásmidos descritos en este manuscrito fueron proporcionados por el Dr. Vladimir Ponomarev.
   2. Transfiera el medio que contiene el reactivo de transfección in vitro de ADN gota a gota al tubo que contiene los plásmidos de ADN (durante aproximadamente 30 s) y mezcle suavemente con una pipeta. Incubar a RT durante 20 min.
   3. Durante esta incubación de 20 minutos, separe las células 293T agregando 5-10 ml de tripsina al 0,05%. Una vez que las células se hayan desprendido, añadir 10 ml de medio y centrifugar a 800 x g durante 5 min. Resuspender las células en 1,5 ml de medios.
   4. Añadir los medios que contienen el reactivo de transfección in vitro de ADN y los plásmidos de ADN a las células 293T e incubar a 37 °C durante 30 min.
   5. Transferir a un matraz T175 y añadir 18 ml de soporte. Incubar a 37 °C durante la noche.
   6. Al día siguiente, aspire cuidadosamente el medio con una pipeta de vidrio sin separar las células. Reemplácelo con 18 ml de medios nuevos. Incubar a 37 °C durante la noche en una incubadora.
3. Recolección de sobrenadante viral
   1. Retire el sobrenadante viral con una pipeta sobre hielo. Centrifugar a 800 x g durante 5 min para granular las células y los residuos.
      NOTA: Si el pellet celular es grande, es probable que las células se interrumpieron del matraz cuando se retiró el sobrenadante. Estas células se pueden volver a colocar en un matraz nuevo con medios frescos.
   2. Filtrar el sobrenadante viral con un filtro de 0,22 μm.
   3. Use el sobrenadante viral inmediatamente. Manténgalo en hielo o a 4 ° C durante un máximo de 24 h, o congélelo a -80 ° C para un almacenamiento a largo plazo.

2. Expansión y transducción de células T humanas activadas con luciferasa

1. Activación de células T humanas in vitro
   1. Lave las perlas agregando 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga 0.1% de albúmina sérica bovina (BSA) y 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a un tubo estéril de 15 ml, agregando perlas (una perla por cada dos células T), colocándolas en un estante magnético durante 2 minutos y succionando el PBS.
   2. Prepare los medios como se describe en el paso 1.1.1, luego agregue IL-2 a una concentración final de 30 UI / ml y agregue las perlas lavadas. Producir 2,5 ml de medios por cada dos millones de células T que se activan.
   3. Contar las células T (recién purificadas o previamente purificadas, congeladas, descongeladas y lavadas) usando un hemocitómetro y tinción azul de tripano. Añadir linfocitos T al medio preparado en el paso 2.1.2 e invertir suavemente el tubo para mezclar. Las células T se expandirán al menos 20 veces dependiendo de la fuente y la salud general de las células. Determine el número de células T a activar calculando el número necesario para tratar a los ratones y dividiendo por 20. Aquí, se utilizaron 20 x 106 células T por ratón basadas en experimentos preliminares.
   4. Placa de 2,5 ml de medios que contienen dos millones de células T, perlas e IL-2 en cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos. Cultivo a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de_CO2 .
   5. Examine las células T bajo un microscopio 20x todos los días durante los próximos 3 días para determinar cuándo transducir con luciferasa. Las células están listas cuando se agrupan y agotan el medio, convirtiéndolo de rojo / rosa a naranja claro.
2. Preparación de placas de retronectina
   NOTA: La retronectina se utiliza para recubrir las placas utilizadas en la transducción, ya que mejora la transducción génica¹⁵.
   1. Agregue 2 ml de retronectina de 20 μg/ml en PBS a un pocillo de una placa de 6 pocillos sin tratar. Incubar durante 2 h a RT o 1 h a 37 °C. Se requiere un pocillo recubierto de retronectina por cada dos millones de células T que se transducen.
   2. Aspirar la retronectina sin rayar el fondo de la placa.
   3. Agregue 3 ml de BSA al 2% en PBS (filtrado estéril) por pocillo en la placa de 6 pocillos. Incubar durante 30 min en RT.
3. Espinoculación
   1. Aspire el BSA sin rayar el fondo de la placa.
   2. Lave los pocillos una vez con 3 ml de PBS por pocillo. Continuar o sustituir por PBS fresco y dejar la placa tapada a 4 °C durante la noche.
   3. Añadir 2 ml de sobrenadante viral de luciferasa CBR-TDR (recogido en el paso 1.3) por pocillo.
   4. Centrifugadora a 1.240 x g durante 90 min a 32 °C.
4. Transducción
   1. Cuenta las células T.
   2. Aspire el sobrenadante viral sin rayar el fondo de la placa.
   3. Placa de dos millones de células T por pocillo en 6 ml del medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 30 UI / ml de IL-2 humana.
   4. Examine las células T diariamente. Las células T están listas para expandirse cuando son casi confluentes, generalmente después de 2 días.
   5. Cuando las células estén casi confluentes, lávelas suavemente del fondo de la placa con una pipeta y transfiera cada pocillo a un matraz T75 separado. Añadir 9 ml de medios para un total de 15 ml de medio por matraz.
   6. Al día siguiente, agregue 15 ml adicionales de medios. Las células deben estar listas para inyectarse en ratones el día después de esta adición de medios. Confirmar el éxito de la transducción mediante la realización de citometría de flujo (la construcción de luciferasa contiene un fluoróforo de tomate TD que es visible en el canal PE)¹⁶.

3. Injerto de células T transducidas por luciferasa en ratones inmunocomprometidos

1. Preparar y contar las células T para inyección.
   1. Retire las células T de los matraces y cuente. Las células están listas para inyectarse cuando se han expandido 20x-30x, generalmente en el día 7 después de la activación.
   2. Centrifugar las células T a 800 x g durante 5 min. Vuelva a suspender en 2 ml de soporte y retire las perlas con un estante magnético.
   3. Para experimentos en los que las células T se inyectarán por separado de anticuerpos biespecíficos, cuente las células T y resuspenda de modo que la concentración final sea de 20 millones de células T por 100 μL de medios. Vaya al paso 3.2. Para experimentos con células T armadas ex vivo (EAT), vaya al paso 3.1.4.
   4. Para experimentos con células T armadas ex vivo , cuente las células T y sepárelas en tubos individuales de 1,5 ml para cada grupo, con 20 millones de células por ratón. Por ejemplo, si hay tres grupos de cinco ratones cada uno, prepare tres tubos de 1,5 ml con 100 millones de células T cada uno.
   5. Centrifugar los tubos de 1,5 ml a 800 x g durante 5 min. Retire el medio con cuidado sin alterar el pellet de células T. Resuspender en no más de 50 μL de medios que contengan los anticuerpos biespecíficos. Incubar a RT durante 30 min.
      NOTA: Para los propósitos de los experimentos realizados en este estudio, se utilizaron anticuerpos biespecíficos patentados de compromiso de células T IgG-[L]-scFv generados en el laboratorio. Para el armado de células T, use 5 μg de anticuerpos por 20 x 10⁶ células T. También podrían utilizarse anticuerpos biespecíficos disponibles comercialmente.
   6. Lave el exceso de anticuerpos agregando 1,450 μL de medios a cada tubo. Centrifugar a 800 x g durante 5 min, aspirar cuidadosamente el medio y resuspender a una concentración de 20 millones de células T armadas por medio de 100 μL.
2. Inyección e injerto en ratones
   1. Anestesiar a los ratones en una cámara que suministre 3,5% (v/v) de isoflurano inhalado en 1 L/min de oxígeno. Los ratones están completamente anestesiados cuando el reflejo de retirada del pedal de las extremidades posteriores ha desaparecido.
      NOTA: Proporcione soporte térmico durante todo el procedimiento.
   2. Usando una aguja de 26 G, inyecte 20 millones de células T en 100 μL de medios retroorbitalmente por ratón.
   3. Administrar 1.000 U de IL-2 recombinante por vía subcutánea para apoyar la supervivencia de las células T in vivo.
   4. Administrar los anticuerpos biespecíficos retroorbitariamente (en el ojo no utilizados para la inyección de células T) o intraperitonealmente. Permita que los ratones se recuperen de la anestesia y regresen a sus jaulas.
      NOTA: Una vez más, aquí, se usaron anticuerpos patentados que se generaron en el laboratorio, pero en su lugar se podrían usar anticuerpos disponibles comercialmente. En los experimentos aquí, se administraron 0.3-10 μg de anticuerpos por ratón por dosis. Los anticuerpos se administraron dos veces por semana durante 3-4 semanas.

4. Imágenes in vivo de ratones injertados con células T transducidas por luciferasa

NOTA: Este paso debe realizarse el día de la obtención de imágenes, que no es necesariamente el mismo día en que se administran las células T y/o los anticuerpos a los ratones. Por lo general, realizamos imágenes 24 h después de la administración de las células T transducidas por luciferasa.

1. Preparación de D-luciferina
   1. Disolver 1 g de D-luciferina en 33,3 mL de PBS estéril (concentración final: 30 mg/mL).
   2. Alícuota la D-luciferina disuelta en tubos de microcentrífuga de 33 x 1,5 ml y mantener los tubos a -20 °C.
   3. El día de la obtención de imágenes, descongelar suficientes alícuotas de 30 mg/ml de D-luciferina para obtener imágenes del número de animales. Un tubo es suficiente para 10 animales.
      NOTA: Vuelva a congelar la D-luciferina restante después de su uso. La D-luciferina es estable durante al menos cinco ciclos de congelación/descongelación.
2. Administración de D-luciferina a ratones
   NOTA: Antes de administrar D-luciferina a los ratones, abra el software de imágenes e inicialice el sistema. La cámara puede tardar varios minutos en enfriarse, y esto debe hacerse antes de que los ratones sean inyectados con D-luciferina para garantizar que la imagen pueda tener lugar 5 minutos después de la administración del sustrato.
   1. Anestesiar hasta cinco ratones en una cámara que suministre 3,5% (v/v) de isoflurano inhalado en 1 L/min de oxígeno. Los ratones están completamente anestesiados cuando el reflejo de retirada del pedal de las extremidades posteriores ha desaparecido.
   2. Una vez que los ratones estén completamente anestesiados, administrar 100 μL de 30 mg/ml de D-luciferina por ratón (3 mg por ratón) mediante inyección retroorbitaria con una aguja de 26 G. Imagen de este grupo de ratones antes de administrar D-luciferina al siguiente grupo. Coloque el siguiente grupo de ratones en la cámara de isoflurano para ser anestesiados mientras se toman imágenes del grupo anterior.
3. Obtención de imágenes de células T transducidas por luciferasa
   1. Mover los ratones anestesiados a la cámara hermética a la luz del generador de imágenes y continuar administrando isoflurano al 3% a 0,5 L/min. Coloque los ratones de lado de tal manera que el flanco que lleva el xenoinjerto esté mirando hacia la cámara. Tome otro conjunto de imágenes con los ratones en posición supina para evaluar la presencia de células T en los pulmones.
   2. Con el Panel de control de adquisición, seleccione Luminiscente, Fotografía y Superposición. Establezca el tiempo de exposición en automático, el binning en medio y F/Stop en 1. Adquirir imágenes. Después de la primera imagen, establezca el tiempo de exposición para que coincida con el que se calculó automáticamente para la primera imagen para que las imágenes posteriores puedan compararse directamente. Puede ser útil capturar imágenes con múltiples tiempos de exposición para determinar el tiempo de exposición óptimo para lograr la señal más brillante sin saturación de píxeles.
   3. Retire a los ratones del isoflurano, regrese a sus jaulas y observe hasta que estén despiertos y ambulatorios.
   4. Repita los pasos del paso 4.2.1 hasta que se haya creado una imagen de todos los grupos.

Resultados

Como se describe en el paso 4.3, los ratones pueden orientarse en diferentes posiciones durante la obtención de imágenes para evaluar la presencia de células T en diferentes tejidos. La posición supina permite la evaluación de las células T en los pulmones, que es común en los primeros momentos después de la inyección. El posicionamiento lateral con el xenoinjerto subcutáneo hacia arriba se utiliza para evaluar mejor el tráfico de células T al tumor. Se utilizaron ratones hembra C.Cg-Rag2^tm1Fwa

Discusión

Si bien el Blinatumomab T-BsAb ha sido aprobado para neoplasias hematológicas CD19 positivas, la implementación exitosa de T-BsAbs en tumores sólidos ha demostrado ser mucho más difícil. El catumaxomab, un T-BsAb dirigido contra la molécula de adhesión de células epiteliales (EPCAM), fue aprobado para el tratamiento de la ascitis maligna en pacientes con cáncer de ovario, pero la producción del fármaco se detuvo posteriormente por razones comerciales¹⁹. No se han aprobado otros T-BsAb p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
293T cells	ATCC	CRL-11268
BSA	Sigma Aldrich	A7030-10G
CD3/CD28 beads	Gibco (ThermoFisher)	11161D
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio	LUCK-1G
DMEM	Gibco (ThermoFisher)	11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet)	SignaGen Laboratories	SL100688
EDTA	Sigma Aldrich	E9884-100G
FBS	Gibco (ThermoFisher)	10437028
Gag/pol plasmid	Addgene	14887
GFP plasmid	Addgene	11150-DNA.cg
Penicilin-Streptomycin	Gibco (ThermoFisher)	15140122
Recombinant human IL-2	R&D Systems	202-IL-010/CF
Retronectin	Takara	T100B
Trypsin	Gibco (ThermoFisher)	25-300-120
VSV-G plasmid	Addgene	8454