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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode de transduction des lymphocytes T humains avec de la luciférase pour faciliter le suivi in vivo du trafic de lymphocytes T induit par les anticorps bispécifiques vers les tumeurs dans des études visant à évaluer l’efficacité antitumorale et le mécanisme des anticorps bispécifiques engageant les lymphocytes T.

Résumé

Les anticorps bispécifiques engageant les lymphocytes T (T-BsAbs) sont à différents stades de développement préclinique et d’essais cliniques pour les tumeurs solides. Des facteurs tels que la valence, l’arrangement spatial, la distance interdomaine et les mutations Fc affectent l’efficacité antitumorale de ces thérapies, généralement en influençant le ralliement des lymphocytes T aux tumeurs, ce qui reste un défi majeur. Ici, nous décrivons une méthode pour transduire les cellules T humaines activées avec la luciférase, permettant le suivi in vivo des cellules T pendant les études de thérapie T-BsAb. La capacité des T-BsAbs à rediriger les cellules T vers les tumeurs peut être évaluée quantitativement à plusieurs moments du traitement, ce qui permet aux chercheurs de corréler l’efficacité antitumorale des T-BsAbs et d’autres interventions avec la persistance des cellules T dans les tumeurs. Cette méthode atténue la nécessité de sacrifier des animaux pendant le traitement pour évaluer histologiquement l’infiltration des lymphocytes T et peut être répétée à plusieurs moments pour déterminer la cinétique du trafic des lymphocytes T pendant et après le traitement.

Introduction

Les anticorps bispécifiques engageant les lymphocytes T (T-BsAbs) sont des anticorps modifiés utilisés pour fournir une spécificité artificielle aux lymphocytes T polyclonaux en engageant les lymphocytes T par un bras de liaison et un antigène tumoral par un autre bras de liaison. Cette technologie a été appliquée avec succès aux cancers hématologiques (blinatumomab1 ciblant CD19), et de nombreux T-BsAbs sont en développement préclinique et clinique pour une variété de tumeurs solides ainsi que2. Les T-BsAbs engagent les lymphocytes T polyclonaux d’une manière indépendante du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) et, par conséquent, même les tumeurs qui régulent à la baisse les antigènes leucocytaires humains (HLA) sont sensibles à ce type de thérapie 3,4. Les T-BsAbs ont été développés dans des dizaines de formats différents, avec des différences dans la valence et la disposition spatiale des bras de liaison aux cellules T et aux tumeurs, les distances interdomaines et l’inclusion d’un domaine Fc, qui affecte la demi-vie et peut induire des fonctions effectrices si présent5. Des travaux antérieurs dans notre laboratoire ont montré que ces facteurs affectent de manière significative l’efficacité antitumorale des T-BsAbs, avec des différences de puissance allant jusqu’à 1 000 fois6. Grâce à ce travail, nous avons identifié le format IgG-[L]-scFv comme la plateforme idéale pour les T-BsAbs (voir la section Résultats représentatifs pour plus de détails sur les formats T-BsAb), et nous avons appliqué cette plateforme à des cibles telles que GD2 (neuroblastome), HER2 (cancer du sein et ostéosarcome), GPA33 (cancer colorectal), STEAP1 (sarcome d’Ewing), CD19 (tumeurs malignes à cellules B) et CD33 (tumeurs malignes à cellules B)7. 8,9,10,11,12,13.

L’un des principaux défis pour réussir la mise en œuvre de la thérapie T-BsAb dans les tumeurs solides est de surmonter un microenvironnement tumoral immunosuppresseur (TME) pour conduire le trafic des lymphocytes T aux tumeurs14. Les facteurs affectant l’efficacité des T-BsAb décrits ci-dessus ont un impact significatif sur la capacité des T-BsAbs à induire efficacement le homing des lymphocytes T vers les tumeurs, mais cet effet est difficile à évaluer dans un système in vivo en temps réel. Ce manuscrit fournit une description détaillée de l’utilisation des lymphocytes T transduits par la luciférase dans les études précliniques des T-BsAbs pour évaluer le trafic des lymphocytes T vers divers tissus dans des modèles expérimentaux de souris immunodéprimées pendant le traitement. L’objectif global de cette méthode est de fournir un moyen d’évaluer l’infiltration des lymphocytes T dans les tumeurs et autres tissus, ainsi qu’un aperçu en temps réel de la cinétique et de la persistance de la localisation des lymphocytes T, sans avoir besoin de sacrifier des animaux pendant le traitement. Pour le nombre croissant de chercheurs qui se concentrent sur les immunothérapies cellulaires, la capacité de suivre les lymphocytes T in vivo dans des modèles animaux précliniques est cruciale. Notre objectif est de fournir une description complète et détaillée de la méthode que nous avons utilisée pour suivre les lymphocytes T transduits par la luciférase afin de permettre à d’autres chercheurs de reproduire facilement cette technique.

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Protocole

Les procédures suivantes ont été évaluées et approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Memorial Sloan Kettering.

1. Transfection de cellules 293T avec luciférase et récolte de surnageant viral

  1. Culture de cellules 293T
    1. Préparer les milieux en ajoutant ce qui suit à un litre de DMEM chacun : 110 mL de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS), 11 mL de pénicilline-streptomycine.
    2. Décongeler 5 cellules x 106 293T et les transférer dans une fiole T175 avec le milieu préparé comme décrit ci-dessus.
    3. Divisez les cellules 293T 1:10 tous les 3 jours pendant 6 jours. Ne laissez pas les cellules devenir confluentes à plus de 90%.
  2. Transfection de cellules 293T
    NOTE: Les quantités suivantes de réactifs sont calculées pour transfecter une fiole T175 de cellules 293T. Ajuster en conséquence si d’autres flacons doivent être transduits.
    1. Transférer 1,5 mL de média dans chacun des deux tubes de 50 ml à l’aide d’une pipette. Dans un tube, ajouter 10 μg de plasmide VSV-G, 20 μg de Gag/pol et 20 μg de plasmide luciférase TD rouge de coléoptère rouge (CBR-TDR) et mélanger. Dans l’autre tube, ajouter 100 μL de réactif de transfection in vitro d’ADN et mélanger. Incuber les deux tubes à température ambiante (RT) pendant 5 min.
      NOTE: Tous les plasmides décrits dans ce manuscrit ont été fournis par le Dr Vladimir Ponomarev.
    2. Transférer goutte à goutte le milieu contenant le réactif de transfection in vitro de l’ADN dans le tube contenant les plasmides d’ADN (sur environ 30 s) et mélanger doucement à l’aide d’une pipette. Incuber à TA pendant 20 min.
    3. Au cours de cette incubation de 20 minutes, détacher les cellules 293T en ajoutant 5 à 10 ml de trypsine à 0,05 %. Une fois les cellules détachées, ajouter 10 mL de média et centrifuger à 800 x g pendant 5 min. Remettez les cellules en suspension dans 1,5 mL de média.
    4. Ajouter le milieu contenant le réactif de transfection in vitro de l’ADN et les plasmides d’ADN aux cellules 293T et incuber à 37 °C pendant 30 min.
    5. Transvaser dans une fiole T175 et ajouter 18 ml de média. Incuber à 37 °C pendant une nuit.
    6. Le lendemain, aspirez soigneusement le média avec une pipette en verre sans détacher les cellules. Remplacer par 18 ml de média frais. Incuber à 37 °C pendant une nuit dans un incubateur.
  3. Récolte du surnageant viral
    1. Retirer le surnageant viral à l’aide d’une pipette placée sur de la glace. Centrifuger à 800 x g pendant 5 min pour pelleter les cellules et les débris.
      REMARQUE : Si la pastille de la cellule est grande, les cellules ont probablement été perturbées du flacon lorsque le surnageant a été retiré. Ces cellules peuvent être plaquées à nouveau dans une nouvelle fiole avec un milieu frais.
    2. Filtrer le surnageant viral à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
    3. Utilisez le surnageant viral immédiatement. Conservez-le sur de la glace ou à 4 °C jusqu’à 24 h, ou congelez-le à -80 °C pour un stockage à long terme.

2. Expansion et transduction des lymphocytes T humains activés avec la luciférase

  1. Activation des lymphocytes T humains in vitro
    1. Lavez les billes en ajoutant 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans un tube stérile de 15 mL, en ajoutant des billes (une bille pour deux lymphocytes T), en les plaçant dans un support magnétique pendant 2 minutes et en aspirant le PBS.
    2. Préparer le milieu comme décrit à l’étape 1.1.1, puis ajouter l’IL-2 jusqu’à une concentration finale de 30 UI/mL et ajouter les billes lavées. Fabriquer 2,5 mL de milieu pour deux millions de lymphocytes T à activer.
    3. Compter les lymphocytes T (fraîchement purifiés ou préalablement purifiés, congelés, décongelés et lavés) à l’aide d’un hémocytomètre et d’une coloration bleue de trypan. Ajouter les lymphocytes T au milieu préparé à l’étape 2.1.2 et retourner délicatement le tube pour mélanger. Les cellules T se développeront au moins 20x selon la source et l’état de santé général des cellules. Déterminer le nombre de lymphocytes T à activer en calculant le nombre nécessaire pour traiter les souris et en divisant par 20. Ici, 20 x 106 cellules T par souris ont été utilisées sur la base d’expériences préliminaires.
    4. Plaque de 2,5 mL de milieu contenant deux millions de lymphocytes T, de billes et d’IL-2 dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Culture à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 .
    5. Examinez les lymphocytes T au microscope 20x tous les jours pendant les 3 prochains jours pour déterminer quand transduire avec la luciférase. Les cellules sont prêtes lorsqu’elles s’agglutinent et épuisent le média, le faisant passer du rouge / rose à l’orange clair.
  2. Préparation des plaques de rétronectine
    REMARQUE: La rétronectine est utilisée pour recouvrir les plaques utilisées dans la transduction car elle améliore la transductiondu gène 15.
    1. Ajouter 2 mL de 20 μg/mL de rétronectine dans du PBS à un puits d’une plaque à 6 puits non traitée. Incuber pendant 2 h à TA ou 1 h à 37 °C. Un puits recouvert de rétronectine est nécessaire pour chaque tranche de deux millions de lymphocytes T à transduire.
    2. Aspirer la rétronectine sans rayer le fond de la plaque.
    3. Ajouter 3 mL de BSA à 2 % dans du PBS (filtré stérile) par puits dans la plaque à 6 puits. Incuber pendant 30 min à RT.
  3. Spinoculation
    1. Aspirer le BSA sans rayer le fond de la plaque.
    2. Lavez les puits une fois avec 3 mL de PBS par puits. Continuer ou remplacer par du PBS frais et laisser la plaque couverte à 4 °C pendant la nuit.
    3. Ajouter 2 mL de surnageant viral luciférase CBR-TDR (recueilli à l’étape 1.3) par puits.
    4. Centrifuger à 1 240 x g pendant 90 min à 32 °C.
  4. Transduction
    1. Comptez les lymphocytes T.
    2. Aspirez le surnageant viral sans gratter le fond de la plaque.
    3. Plaquer deux millions de lymphocytes T par puits dans 6 mL de milieu d’Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 30 UI/mL d’IL-2 humaine.
    4. Examinez les lymphocytes T quotidiennement. Les lymphocytes T sont prêts à être dilatés lorsqu’ils sont presque confluents, généralement après 2 jours.
    5. Lorsque les cellules sont presque confluentes, les laver délicatement du fond de la plaque à l’aide d’une pipette et transférer chaque puits dans une fiole T75 séparée. Ajouter 9 mL de fluide pour un total de 15 mL de média par fiole.
    6. Le lendemain, ajoutez 15 ml de média supplémentaires. Les cellules doivent être prêtes à être injectées dans les souris le lendemain de cet ajout de milieu. Confirmer la réussite de la transduction en effectuant une cytométrie en flux (la construction de la luciférase contient un fluorophore de tomate TD visible dans le canal PE)16.

3. Greffe de lymphocytes T transduits par la luciférase chez des souris immunodéprimées

  1. Préparer et compter les lymphocytes T pour injection.
    1. Retirez les lymphocytes T des flacons et comptez. Les cellules sont prêtes à s’injecter lorsqu’elles se sont dilatées de 20 à 30 fois, généralement au jour 7 après l’activation.
    2. Centrifuger les lymphocytes T à 800 x g pendant 5 min. Remettez en suspension dans 2 ml de média et retirez les billes à l’aide d’un support magnétique.
    3. Pour les expériences où les lymphocytes T seront injectés séparément des anticorps bispécifiques, compter les lymphocytes T et les remettre en suspension de sorte que la concentration finale soit de 20 millions de lymphocytes T par 100 μL de milieu. Passez à l’étape 3.2. Pour les expériences utilisant des lymphocytes T armés ex vivo (EAT), passez à l’étape 3.1.4.
    4. Pour les expériences utilisant des cellules T armées ex vivo , compter les cellules T et les séparer en tubes individuels de 1,5 mL pour chaque groupe, avec 20 millions de cellules par souris. Par exemple, s’il y a trois groupes de cinq souris chacun, préparez trois tubes de 1,5 mL avec 100 millions de lymphocytes T chacun.
    5. Centrifuger les tubes de 1,5 mL à 800 x g pendant 5 min. Retirez le média avec précaution sans déranger la pastille de lymphocytes T. Remettre en suspension dans un maximum de 50 μL de milieu contenant les anticorps bispécifiques. Incuber à TA pendant 30 min.
      REMARQUE : Aux fins des expériences menées dans le cadre de cette étude, des anticorps bispécifiques exclusifs engageant les lymphocytes T IgG-[L]-scFv et générés en laboratoire ont été utilisés. Pour l’armement des lymphocytes T, utiliser 5 μg d’anticorps pour 20 x 106 lymphocytes T. Des anticorps bispécifiques disponibles dans le commerce pourraient également être utilisés.
    6. Éliminer l’excès d’anticorps en ajoutant 1 450 μL de milieu à chaque tube. Centrifuger à 800 x g pendant 5 min, aspirer soigneusement le milieu et remettre en suspension à une concentration de 20 millions de lymphocytes T armés par milieu de 100 μL.
  2. Injection et greffe chez la souris
    1. Anesthésier les souris dans une chambre fournissant 3,5 % (v/v) d’isoflurane inhalé dans 1 L/min d’oxygène. Les souris sont entièrement anesthésiées lorsque le réflexe de retrait de la pédale des membres postérieurs a disparu.
      REMARQUE: Fournir un support thermique tout au long de la procédure.
    2. À l’aide d’une aiguille de 26 G, injecter 20 millions de lymphocytes T dans 100 μL de média rétroorbitalement par souris.
    3. Administrer 1 000 UI d’IL-2 recombinante par voie sous-cutanée pour soutenir la survie des lymphocytes T in vivo.
    4. Administrer les anticorps bispécifiques rétroorbitalement (dans l’œil non utilisé pour l’injection de lymphocytes T) ou intrapéritonéal. Laissez les souris se remettre de l’anesthésie et retournez dans leurs cages.
      REMARQUE: Encore une fois, ici, des anticorps exclusifs générés en laboratoire ont été utilisés, mais des anticorps disponibles dans le commerce pourraient être utilisés à la place. Dans les expériences ici, 0,3-10 μg d’anticorps par souris et par dose ont été administrés. Les anticorps ont été administrés deux fois par semaine pendant 3-4 semaines.

4. Imagerie in vivo de souris greffées avec des lymphocytes T transduits par la luciférase

NOTE: Cette étape doit être effectuée le jour de l’imagerie, qui n’est pas nécessairement le même jour que les cellules T et / ou les anticorps sont administrés aux souris. En règle générale, nous effectuons une imagerie 24 heures après l’administration des lymphocytes T transduits par la luciférase.

  1. Préparation de D-luciférine
    1. Dissoudre 1 g de D-luciférine dans 33,3 mL de PBS stérile (concentration finale : 30 mg/mL).
    2. Aliquote la D-luciférine dissoute dans 33 tubes microcentrifuges de 1,5 mL et maintenir les tubes à -20 °C.
    3. Le jour de l’imagerie, décongeler suffisamment d’aliquotes de 30 mg/mL de D-luciférine pour que le nombre d’animaux soit imagée. Un tube suffit pour 10 animaux.
      REMARQUE: Recongeler le reste de la D-luciférine après utilisation. La d-luciférine est stable pendant au moins cinq cycles de gel/dégel.
  2. Administration de D-luciférine à la souris
    REMARQUE: Avant d’administrer la D-luciférine aux souris, ouvrez le logiciel d’imagerie et initialisez le système. La caméra peut prendre plusieurs minutes à refroidir, et cela devrait être fait avant que les souris ne soient injectées avec D-luciférine pour s’assurer que l’imagerie peut avoir lieu 5 minutes après l’administration du substrat.
    1. Anesthésier jusqu’à cinq souris dans une chambre fournissant 3,5 % (v/v) d’isoflurane inhalé dans 1 L/min d’oxygène. Les souris sont entièrement anesthésiées lorsque le réflexe de retrait de la pédale des membres postérieurs a disparu.
    2. Une fois les souris complètement anesthésiées, administrer 100 μL de D-luciférine à 30 mg/mL par souris (3 mg par souris) par injection rétroorbitaire avec une aiguille de 26 G. Imaginez ce groupe de souris avant d’administrer la D-luciférine au groupe suivant. Placez le groupe de souris suivant dans la chambre d’isoflurane à anesthésier pendant que le groupe précédent est photographié.
  3. Imagerie des lymphocytes T transduits par la luciférase
    1. Déplacer les souris anesthésiées dans la chambre étanche à la lumière de l’imageur et continuer à administrer de l’isoflurane à 3 % à 0,5 L/min. Placez les souris sur le côté de manière à ce que le flanc portant la xénogreffe soit tourné vers la caméra. Prenez une autre série d’images avec les souris en décubitus dorsal pour évaluer la présence de lymphocytes T dans les poumons.
    2. À l’aide du Panneau de configuration des acquisitions, sélectionnez Luminescent, Photographie et Superposition. Définissez le temps d’exposition sur auto, le binning sur moyen et F/Stop sur 1. Acquérir des images. Après la première image, définissez le temps d’exposition pour qu’il corresponde à celui qui a été calculé automatiquement pour la première image afin que les images suivantes puissent être comparées directement. Il peut être utile de capturer des images avec plusieurs temps d’exposition pour déterminer le temps d’exposition optimal pour obtenir le signal le plus lumineux sans saturation de pixels.
    3. Retirez les souris de l’isoflurane, retournez dans leurs cages et observez-les jusqu’à ce qu’elles soient éveillées et ambulatoires.
    4. Répétez les étapes de l’étape 4.2.1 jusqu’à ce que tous les groupes aient été imagés.

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Résultats

Comme décrit à l’étape 4.3, les souris peuvent être orientées dans différentes positions pendant l’imagerie pour évaluer la présence de lymphocytes T dans différents tissus. Le positionnement en décubitus dorsal permet d’évaluer les lymphocytes T dans les poumons, ce qui est courant aux premiers moments après l’injection. Le positionnement latéral avec la xénogreffe sous-cutanée tournée vers le haut est utilisé pour évaluer au mieux le trafic des lymphocytes T vers la tumeur. Des souris femelles...

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Discussion

Alors que le blinatumomab T-BsAb a été approuvé pour les hémopathies malignes CD19 positives, la mise en œuvre réussie des T-BsAbs dans les tumeurs solides s’est avérée beaucoup plus difficile. Le catumaxomab, un T-BsAb dirigé contre la molécule d’adhésion des cellules épithéliales (EPCAM), a été approuvé pour le traitement de l’ascite maligne chez les patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire, mais la production du médicament a ensuite été arrêtée pour des raisons commerciales

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Déclarations de divulgation

NKC déclare avoir reçu des subventions de recherche commerciale de Y-mAbs Therapeutics. NKC est l’inventeur et le propriétaire des brevets délivrés sous licence par MSK à Y-mAbs Therapeutics, Biotec Pharmacon/Lallemand et Abpro-labs. MSK et NKC ont des intérêts financiers dans Y-mAbs. NKC déclare avoir reçu des options d’achat d’actions d’Eureka Therapeutics. HFG et MEC n’ont pas de divulgations pertinentes.

Remerciements

Les auteurs aimeraient remercier le Dr Vladimir Ponomarev d’avoir partagé les constructions de luciférase utilisées dans les expériences décrites dans la section des résultats représentatifs de cet article.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
293T cellsATCCCRL-11268
BSASigma AldrichA7030-10G
CD3/CD28 beadsGibco (ThermoFisher)11161D
D-Luciferin, Potassium SaltGoldbioLUCK-1G
DMEMGibco (ThermoFisher)11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet)SignaGen LaboratoriesSL100688
EDTASigma AldrichE9884-100G
FBSGibco (ThermoFisher)10437028
Gag/pol plasmidAddgene14887
GFP plasmidAddgene11150-DNA.cg
Penicilin-StreptomycinGibco (ThermoFisher)15140122
Recombinant human IL-2R&D Systems202-IL-010/CF
RetronectinTakaraT100B
TrypsinGibco (ThermoFisher)25-300-120
VSV-G plasmidAddgene8454

Références

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