JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول الحالي الحقن داخل القناة للنواقل الفيروسية عبر الحلمة لتوصيل الجينات ذات الأهمية إلى الخلايا الظهارية الثديية.

Abstract

تتكون الغدد الثديية للفأر من أشجار الأقنية ، التي تصطف على جانبيها الخلايا الظهارية ولها فتحة واحدة عند طرف كل حلمة. تلعب الخلايا الظهارية دورا رئيسيا في وظيفة الغدة الثديية وهي أصل معظم أورام الثدي. يعد إدخال الجينات ذات الأهمية في الخلايا الظهارية الثديية للفأر خطوة حاسمة في تقييم وظيفة الجينات في الخلايا الظهارية وتوليد نماذج أورام الثدي الثديية للفئران. يمكن تحقيق هذا الهدف من خلال الحقن داخل القناة لناقل فيروسي يحمل الجينات ذات الأهمية إلى شجرة الأقنية الثديية للفأر. يصيب الفيروس المحقون لاحقا الخلايا الظهارية الثديية ، مما يجلب الجينات ذات الأهمية. يمكن أن يكون الناقل الفيروسي فيروسيا عدسيا أو قهقريا أو غديا أو مرتبطا بالفيروس الغدي (AAV). توضح هذه الدراسة كيف يتم تسليم الجين محل الاهتمام إلى الخلايا الظهارية الثديية من خلال الحقن داخل القناة الثديية للفأر لناقل فيروسي. يستخدم الفيروس العدسي الذي يحمل GFP لإظهار التعبير المستقر عن الجين الذي تم تسليمه ، ويستخدم الفيروس القهقري الذي يحمل Erbb2 (HER2 / Neu) لإظهار الآفات المفرطة التنسج اللانمطية التي يسببها الجين الورمي وأورام الثدي.

Introduction

تلعب الخلايا الظهارية للغدد الثديية دورا رئيسيا في وظيفة هذه الغدد وهي الخلية الرئيسية لسرطان الثدي. غالبا ما تحتاج دراسات بيولوجيا الغدة الثديية وتكوين الأورام إلى توصيل الجينات (الجينات) ذات الأهمية إلى هذه الخلايا. تتكون كل غدة ثديية فأر من شجرة قنوية مبطنة بخلايا ظهارية مع فتحة واحدة عند طرف الحلمة. هذا الهيكل يجعل الخلايا الظهارية الثديية سهلة الوصول إلى النواقل الفيروسية ، والتي يمكن توصيلها إلى تجويف شجرة الأقنية عن طريق الحقن داخل القناة1.

تم استخدام تقنية الحقن داخل القناة الثديية في الأصل للحيوانات الأكبر بكثير مثل الماعز والأرانب والجرذان1. بالنسبة لحيوان أصغر بكثير مثل الفئران ، يحتاج الحقن داخل القناة إلى العديد من الأدوات الدقيقة والمزيد من ممارسات المشغلين. هناك طريقتان لحقن الماوس داخل القناة. واحد هو حقن الحلمة1. واحد آخر هو الحقن المباشر للقناة الأولية للغدة الثديية # 3 أو # 4 بعد التعرض الجراحي1. نظرا لأن التقنية الأولى غير جراحية وأسرع بمجرد تدريب المشغل جيدا ، فإن هذه التقنية أكثر شيوعا وسيتم وصفها بالتفصيل في هذه المقالة.

بالمقارنة مع نماذج الفئران المعدلة وراثيا التقليدية المستخدمة على نطاق واسع ، والتي يتم فيها إدخال الجين محل الاهتمام في مرحلة البويضات المخصبة من خلال الحقن المجهري2،3،4 ، فإن توصيل الجينات من خلال طريقة حقن الفيروس داخل القناة له العديد من المزايا ، بما في ذلك: (1) يتجنب العملية التي تستغرق وقتا طويلا لإنشاء خط فأر معدل وراثيا لكل جين مهم ؛ (2) يتجنب الضعف المحتمل على التطور الطبيعي للغدد الثديية التي يفرضها الجين محل الاهتمام ؛ (3) يقدم الجين محل الاهتمام في أي وقت مرغوب فيه بعد الولادة ؛ (4) يمكنه بسهولة إدخال أكثر من جين واحد مثير للاهتمام ؛ (5) إنه يحاكي بشكل أفضل عملية الأورام الطبيعية لأن الخلايا المصابة وبالتالي الخلايا الحاملة للجينات المسرطنة محاطة بخلايا طبيعية ؛ و (6) بالاشتراك مع تقنية TVA (فيروس الورم A ، وهو بروتين سطح خلية الطيور ومستقبلات ناقل RCAS للفيروس القهقري)5 ، يمكن إدخال الجين محل الاهتمام في مجموعة خلايا معينة لدراسة أصل الخلية من تكوين الورم وإجراء فحوصات تتبع نسب الخلايا في الغدد الثديية6،7،8 ، 9.

يمكن استخدام أي نواقل مشتقة من الفيروس القهقري 10 والفيروس العدسي11،12 والفيروس الغدي 13 والفيروس المرتبط بالفيروس الغدي (AAV)14 لإيصال المواد الجينية داخل القناة. تندمج ناقلات الفيروسات القهقرية والفيروسات العدسية في جينوم المضيف بشكل دائم. وبالتالي ، فإنها تدخل الجينات ذات الأهمية بثبات في الخلايا الظهارية الثديية. في حين أن فيروس lentivirus يمكن أن يندمج في جينوم أي خلية يواجهها15 ، فإن التكامل الجينومي الفعال للفيروس القهقري يحتاج إلى تكاثر الخلايا المستهدفة16. لا تندمج ناقلات الفيروسات الغدانية و AAV في جينوم الخلايا المصابة ، وبالتالي ، تعبر فقط بشكل عابر عن الجين محل الاهتمام17,18. يمكن أن تكون هذه الميزة ميزة عندما يحتاج الجين محل الاهتمام إلى التعبير عنه لفترة قصيرة فقط من الوقت ، مثل Cre ، لحذف جين مثبط للورم المتخبط.

يصيب فيروس Lentivirus والفيروس الغدي و AAV أي خلايا فأر يواجهونها. ولكن نظرا لأن الظهارة اللمعية معزولة إلى حد كبير عن الطبقة القاعدية الأساسية ، والتي يتم فصلها عن السدى بواسطة الغشاء القاعدي ، فإن الحقن داخل القناة يحد العدوى إلى حد كبير من الخلايا الظهارية اللمعية ، وهي الخلية الأولية لسرطان الثدي. داخل هذه الطبقة الطلائية اللمعية، توجد أيضا أنواع فرعية مميزة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجذعية، والخلايا السلفية، وعدة مجموعات من الخلايا المتمايزة. لإصابة مجموعات فرعية معينة من الخلايا داخل مجموعة الخلايا اللمعية ، يمكن استخدام تقنية TVA ، حيث تصيب ناقلات RCAS المشتقة من فيروس ابيضاض الدم في الطيور 5,10 أو ناقلات الفيروسات العدسيةالكاذبة 11 بشكل انتقائي الخلايا التي تعبر عن TVA في الفئران التي تحمل جين التحوير tva تحت سيطرة مروج خاص بنوع الخلية ، مثل المروج الذي ينشط فقط في الخلايا الجذعية 6 أو بعض الأسلاف 6 ، 7 أو الخلايا السنخية8 أو الخلايا النشطة Wnt-pathway9.

يقدم هذا البروتوكول تقنية إدخال الجينات ذات الأهمية في الخلايا الظهارية الثديية من خلال الحقن داخل القناة لناقل فيروسي. ثم يتم الكشف عن التعبير عن الجينات المدخلة والآفات والأورام المفرطة التنسج الناتجة.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام الفئران وفقا لبروتوكول الحيوانات المعتمد من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية. بالنسبة للدراسة الحالية ، تم استخدام إناث الفئران FVB / N أو MMTV-tva البالغة من العمر 9-12 أسبوعا. تم الحصول على الفئران تجاريا أو عصاميا (انظر جدول المواد). تم استخدام فيروسات Lenti-EGFP (FUCGW) و RCAS-Erbb2 (Neu). تم إجراء تحضير الفيروس وتحديد العيار بعد التقارير المنشورة سابقا10,12.

1. إعداد حقنة

  1. قطع إبر المحور المعدني 33 G (انظر جدول المواد) إلى حوالي 1 سم في الطول. قم بتخزين الإبر والمحقنة سعة 50 ميكرولتر في 70٪ كحول بعد التعقيم.
  2. اخراج المحاقن والإبر من الكحول. ادفع الكحول المتبقي من المحقنة والإبرة. قم بتفكيك المحقنة لتجفيف الهواء على وسادة مقعد ماصة معقم.
  3. تجميع حقنة بعد التجفيف.

2. إعداد الفيروس

  1. أخرج أنبوبا واحدا أو أكثر من أنابيب المخزون الفيروسية حسب الحاجة من الفريزر -80 درجة مئوية وقم بإذابة الفيروس على الجليد.
    ملاحظة: اعتمادا على عدد الخلايا المصابة ، قد يحتاج الفيروس إلى تخفيفه إلى عيار مقصود باستخدام 1x PBS في هذا الوقت.
  2. أضف بروموفينول أزرق عن طريق غمس طرف الماصة على عمق 1 سم في مسحوق البروموفينول الأزرق (انظر جدول المواد). ثم ، قم بإحضار الكمية النزرة المرفقة من البروموفينول الأزرق إلى معلق الفيروس.
    ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، يكون المخزون الفيروسي عادة 200 ميكرولتر لكل أنبوب ، وبالتالي فإن تركيز الصبغة النهائي هو حوالي 0.2٪ (0.2 ميكروغرام / 100 ميكرولتر). يجب تعقيم البروموفينول الأزرق بإشعاع الميكروويف لمدة 45 ثانية بقوة عالية تبلغ 1250 واط (انظر جدول المواد). تأكد من تنفيذ الإجراء بأكمله في بيئة معقمة.
  3. امزج البروموفينول الأزرق مع محلول الفيروس عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10 مرات.
  4. ضع الفيروس على الجليد وأحضر دلو الثلج إلى بيت الحيوان.

3. إعداد الحيوان

  1. تخدير أنثى فأر عن طريق الحقن داخل الصفاق بمقدار 2 ميكرولتر / جم من مخدر (37.6 مجم / مل من الكيتامين ، 1.92 مجم / مل زيلازين ، و 0.38 مجم / مل من الأسيبرومازين ، انظر جدول المواد). تحقق من عمق التخدير بقرصة إصبع القدم. ضع مرهما على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
    ملاحظة: يجب أن يكون الماوس غير مستجيب لقرص إصبع القدم تحت التخدير الجيد. يمكن أيضا استخدام Isoflurane لتخدير الفئران.
  2. ضع الماوس في وضع ضعيف على وسادة دافئة وأرفق جميع الأطراف الأربعة بالمقعد باستخدام شريط لاصق.
  3. تحديد حلمة واحدة (أو أكثر) ليتم حقنها (الرقم 4 مفضل لهذه الدراسة). اعرضيه عن طريق قص الشعر المحيط باستخدام مقص.
  4. ضعي 70٪ من الكحول ومسحات اليودوفور على منطقة الحلمة في ثلاث جولات لتنظيف الحلمة وكشفها.

4. الحقن داخل القناة للفيروس

ملاحظة: يمكن استخدام مصباح مكبرة للمساعدة في تصور فتحة الحلمة.

  1. قم بتحريك الطرف البعيد للحلمة باستخدام مقص زنبركي معقم للتشريح المجهري ، حتى يمكن رؤية فتحة قنوية مركزية صغيرة تحت مصباح مكبر (انظر جدول المواد).
  2. قم بتحميل 10 ميكرولتر من خليط الفيروس / البروموفينول الأزرق في المحقنة.
    ملاحظة: يتم استخدام Lenti-EGFP (FUCGW) و RCAS-Erbb2 (Neu) في هذا العرض التوضيحي.
  3. أدخل الإبرة بعناية في فتحة الحلمة بمساعدة مصباح المكبر. يتم ضبط اتجاه الإبرة قليلا من الإنسي إلى الجانبي لمحاذاة القناة الرئيسية.
  4. حقن كامل 10 ميكرولتر من الفيروس في شجرة القناة.
    ملاحظة: يجب أن تتحول القنوات تحت الجلد إلى اللون الأزرق ، إذا كان الحقن ناجحا. أي مقاومة أو ظهور تغيير اللون الموضعي يشير إلى فشل الحقن.
  5. ضع الماوس على جهاز تدفئة منزلق مضبوط على 45 درجة مئوية حتى يستيقظ الماوس تماما (~ 30-60 دقيقة).

5. الكشف عن الخلايا المصابة بواسطة مجهر مجسم فلوري

  1. بعد ثلاثة إلى خمسة أيام من حقن الفيروس الذي يحمل GFP أو جينات الفلورسنت الأخرى ، يتم القتل الرحيم للفأر عن طريق تناول جرعة زائدة منه بجرعة زائدة مع 4 ميكرولتر / جم من المخدر (37.6 مجم / مل من الكيتامين ، 1.92 مجم / مل زيلازين ، و 0.38 مجم / مل من الأسيبرومازين).
  2. افتح التجويف الصدري. قطع الجلد على طول الخط الأوسط البطني وعلى طول الأطراف العلوية والسفلية باستخدام مقص. رفع الجلد وفضح الغدد الثديية.
  3. إزالة الغدة الثديية المحقونة من الجلد باستخدام زوج من الملقط والمقص. أيضا ، قم بإزالة الغدة غير المحقونة كعنصر تحكم.
  4. ضع الغدد الثديية على شرائح زجاجية وانشر الغدد إلى شكلها الأصلي.
  5. مراقبة وتصوير الغدد تحت المجهر المجسم الفلوري.

النتائج

يتم تقديم البيانات التمثيلية هنا لإثبات نجاح الحقن داخل القناة ، والعدوى الفيروسية الناجحة ، وتأثير الجينات التي تم تسليمها على تكوين أورام الثدي. يجب أن تكون كمية الفيروس المحقون مصممة خصيصا لغرض كل تجربة. لتوضيح مدى انتشار إصابة شجرة القناة الثديية ، يجب استخدام كمية كبيرة من الجينات ا?...

Discussion

توضح هذه المقالة تقنية الحقن الفيروسي داخل القناة لإدخال الجينات في الخلايا الظهارية الثديية للفأر لنمذجة سرطان الثدي المتقطع. عادة ، يتم حقن الفئران التي لا تقل عن 5 أسابيع أو أكثر بحيث تبدأ عملية الأورام بعد تطور الغدة الثديية. إلى جانب ذلك ، غالبا ما تكون فتحة الحلمة للفئران التي يقل عم?...

Disclosures

يعلن كلا المؤلفين عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر الدكتور غاري شامنس على تعليقاته المفيدة على هذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الدفاع (DOD) CDMRP BC191649 (YL) و BC191646 (YL) بالإضافة إلى المعاهد الوطنية للصحة (NIH) CA271498 (YL). يود المؤلفون أن يشكروا المرفق الأساسي لعلم أمراض الثدي المدعوم من SPORE P50CA186784 ، و Cytometry and Cell Sorting Core المدعوم من CPRIT-RP180672 و NIH CA125123 و RR024574 بمساعدة جويل إم سيديرستروم.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-HA antibodyCovanceMMS-101PDilution: 1 : 1000
Artificial TearsCovetrusNDC 11695-0832-1
Bromophenol blueSigmaB5525microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven
FACSCantoIIBD BiosciencesV96100899
Fluorescent stereomicroscopeLeicaMZ16 FA
FUCGW lenti-virusSelf-madeN/ASee reference # 12
FVB/NThe Jackson LaboratoryJAX:001800
Hamilton needleHamilton91033autoclaved
Hamilton syringeHamilton201000autoclaved
LED magnifying lampIntertek3165273
Micro dissection spring scissorRobozRS-5621autoclaved
MMTV-tvaSelf-madeSee reference # 10
RCAS-Neu (HA)Self-madeN/ASee reference # 10
Rodent Comboanesthetic IIIVeterinary PharmacyVeterinary prescription37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine

References

  1. Nguyen, D. -. A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C., Ip, M. M., Asch, B. B. . Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Eds Margot. , 259-270 (2000).
  2. Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
  3. Costantini, F., Lacy, E. Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line. Nature. 294 (5836), 92-94 (1981).
  4. Brinster, R. L., et al. Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. Cell. 27 (1), 223-231 (1981).
  5. Du, Z., Li, Y. RCAS-TVA in the mammary gland: an in vivo oncogene screen and a high fidelity model for breast transformation. Cell Cycle. 6 (7), 823-826 (2007).
  6. Bu, W., et al. Mammary precancerous stem and non-stem cells evolve into cancers of distinct subtypes. Cancer Research. 79 (1), 61-71 (2019).
  7. Bu, W., et al. Keratin 6a marks mammary bipotential progenitor cells that can give rise to a unique tumor model resembling human normal-like breast cancer. Oncogene. 30 (43), 4399-4409 (2011).
  8. Haricharan, S., et al. Contribution of an alveolar cell of origin to the high-grade malignant phenotype of pregnancy-associated breast cancer. Oncogene. 33 (50), 5729-5739 (2014).
  9. Bu, W., Zhang, X., Dai, H., Huang, S., Li, Y. Mammary cells with active Wnt signaling resist ErbB2-induced tumorigenesis. PLoS One. 8 (11), 78720 (2013).
  10. Du, Z., et al. Introduction of oncogenes into mammary glands in vivo with an avian retroviral vector initiates and promotes carcinogenesis in mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17396-17401 (2006).
  11. Siwko, S. K., et al. Lentivirus-mediated oncogene introduction into mammary cells in vivo induces tumors. Neoplasia. 10 (7), 653-662 (2008).
  12. Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 14 (4), 401-404 (2009).
  13. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).
  14. Wagner, S., Thresher, R., Bland, R., Laible, G. Adeno-associated-virus-mediated transduction of the mammary gland enables sustained production of recombinant proteins in milk. Scientific Reports. 5, 15115 (2015).
  15. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  16. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
  17. Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Current Gene Therapy. 2 (2), 135-144 (2002).
  18. McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
  19. Bu, W., Li, Y. Intraductal injection of lentivirus vectors for stably introducing genes into rat mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 389-396 (2020).
  20. Dong, J., et al. Genetic manipulation of individual somatic mammary cells in vivo reveals a master role of STAT5a in inducing alveolar fate commitment and lactogenesis even in the absence of ovarian hormones. Developmental Biology. 346 (2), 196-203 (2010).
  21. Haricharan, S., et al. Mechanism and preclinical prevention of increased breast cancer risk caused by pregnancy. eLife. 2, 00996 (2013).
  22. Reddy, J. P., et al. Defining the ATM-mediated barrier to tumorigenesis in somatic mammary cells following ErbB2 activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3728-3733 (2010).
  23. Dong, J., et al. The PR status of the originating cell of ER/PR-negative mouse mammary tumors. Oncogene. 35 (31), 4149-4154 (2016).
  24. Young, A., et al. Targeting the pro-survival protein BCL-2 to prevent breast cancer. Cancer Prevention Research. 15 (1), 3-10 (2022).
  25. Schlimgen, R., et al. Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
  26. Holloway, K. R., et al. Krt6a-positive mammary epithelial progenitors are not at increased vulnerability to tumorigenesis initiated by ErbB2. PLoS One. 10 (1), 0117239 (2015).
  27. Holloway, K. R., et al. Targeting oncogenes into a defined subset of mammary cells demonstrates that the initiating oncogenic mutation defines the resulting tumor phenotype. International Journal of Biological Sciences. 12 (4), 381-388 (2016).
  28. Hein, S. M., et al. Luminal epithelial cells within the mammary gland can produce basal cells upon oncogenic stress. Oncogene. 35 (11), 1461-1467 (2015).
  29. Annunziato, S., et al. In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer. EMBO Journal. 39 (5), 102169 (2020).
  30. Annunziato, S., et al. Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes & Development. 30 (12), 1470-1480 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved