ב Vivo העברת גנים לתאי אפיתל חלב עכבר באמצעות הזרקה intraductal חלב

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הזרקה אינטרדוקטלית של וקטורים נגיפיים דרך הטיט כדי להעביר גנים מעניינים לתאי אפיתל החלב.

Abstract

בלוטות החלב של העכבר מורכבות מעצים צינוריים, המרופדים בתאי אפיתל ויש להם פתח אחד בקצה כל פטמה. תאי האפיתל ממלאים תפקיד מרכזי בתפקוד בלוטת החלב והם המקור לרוב גידולי החלב. החדרת גנים מעניינים לתאי אפיתל של חלב עכברים היא צעד קריטי בהערכת תפקוד גנים בתאי אפיתל ויצירת מודלים של גידולי חלב עכבריים. מטרה זו יכולה להיות מושגת באמצעות הזרקה intraductal של וקטור נגיפי הנושא את הגנים של עניין לתוך עץ החלב עכבר. הנגיף המוזרק מדביק לאחר מכן תאי אפיתל חלב, ומביא את הגנים המעניינים. הווקטור הנגיפי יכול להיות לנטיויראלי, רטרו-ויראלי, אדנוביראלי או אדנו-וירוס הקשור לנגיפים (AAV). מחקר זה מדגים כיצד גן מעניין מועבר לתאי אפיתל חלב באמצעות הזרקה אינטרדוקטלית של וקטור נגיפי של עכבר. לנטיוירוס הנושא GFP משמש להצגת ביטוי יציב של גן מועבר, ורטרו-וירוס הנושא Erbb2 (HER2/Neu) משמש להדגמת נגעים היפרפלסטיים לא טיפוסיים הנגרמים על ידי אונקוגנים וגידולי חלב.

Introduction

תאי אפיתל של בלוטות החלב ממלאים תפקיד מרכזי בתפקוד בלוטות אלה והם תא המקור העיקרי של סרטן השד. מחקרים על ביולוגיה של בלוטת החלב וגידולים לעתים קרובות זקוקים להעברת גנים בעלי עניין לתאים אלה. כל בלוטת חלב של עכבר מורכבת מעץ צינורי מרופד בתאי אפיתל עם פתח יחיד בקצה הפטמה. מבנה זה הופך את תאי אפיתל החלב לנגישים בקלות לווקטורים נגיפיים, אשר יכולים להיות מועברים לתוך לומן של עץ דוקטלי באמצעות הזרקה intraductal¹.

הטכניקה של הזרקה intraductal חלב שימש במקור עבור בעלי חיים גדולים בהרבה כגון עזים, ארנבות, חולדות¹. עבור חיה קטנה בהרבה כמו עכברים, הזרקה אינטרדוקטלית דורשת כלים עדינים רבים ושיטות עבודה רבות יותר של המפעילים. ישנן שתי גישות להזרקת עכבר intraductal. האחת היא זריקה^1. עוד אחד הוא הזרקה ישירה של הצינור הראשוני של #3 או #4 בלוטת החלב לאחר חשיפה כירורגית¹. מכיוון שהראשון אינו פולשני ומהיר יותר ברגע שהמפעיל הוכשר היטב, טכניקה זו נפוצה יותר ותתואר בפירוט במאמר זה.

בהשוואה למודלים הנפוצים של עכברים טרנסגניים מסורתיים, שבהם הגן המעניין מוצג בשלב של ביציות מופרות באמצעות מיקרו-הזרקה ^2,3,4, להעברת גנים בשיטת הזרקת הנגיף התוך צינורי יש יתרונות רבים^, כולל: (1) הוא מונע את התהליך הגוזל זמן של יצירת קו עכבר מהונדס עבור כל גן מעניין; (2) הוא מונע פגיעה פוטנציאלית בהתפתחות תקינה של בלוטות החלב המוטלת על ידי הגן המעניין; (3) הוא מציג את הגן המעניין בכל עת רצויה לאחר הלידה; (4) הוא יכול בקלות להכניס במשותף יותר מגן אחד של עניין; (5) הוא מחקה טוב יותר את התהליך הגידולי הטבעי משום שהתאים הנגועים ולכן נושאי האונקוגן מוקפים בתאים נורמליים; ו-(6) בשילוב עם טכנולוגיית TVA (וירוס הגידול A, חלבון פני השטח של תאי העופות והקולטן לווקטור RCAS רטרו-וירוס)⁵, ניתן להחדיר את הגן המעניין לאוכלוסיית תאים ספציפית כדי לחקור את מקור התא של גידולים ולבצע בדיקות מעקב אחר שושלת תאים בבלוטות החלב ^{6,7,8, 9}.

כל וקטור הנגזר רטרווירוס¹⁰, lentivirus 11,12, adenovirus^13, ווירוס הקשור אדנווירוס (AAV)¹⁴ עשוי לשמש להעברה intraductal של חומרים גנטיים. רטרו-וירוס ווקטורים של לנטי-וירוס משתלבים בגנום המארח לצמיתות; לכן, הם מציגים גנים של עניין יציב לתוך תאי אפיתל החלב. בעוד שלנטיוירוס יכול להשתלב בגנום של כל תא שהוא פוגש¹⁵, האינטגרציה הגנומית היעילה של רטרו-וירוס זקוקה להתרבות תאי המטרה¹⁶. וקטורי אדנו-ויראלי ו-AAV אינם משתלבים בגנום של תאים נגועים, ולכן מבטאים רק באופן ארעי את הגן המעניין^17,18. תכונה זו יכולה להוות יתרון כאשר הגן המעניין צריך לבוא לידי ביטוי לפרק זמן קצר בלבד, כגון Cre, למחיקת גן מדכא גידול פלוקס.

Lentivirus, adenovirus, ו- AAV מדביקים כל תאי עכבר שהם נתקלים בהם. אך מכיוון שהאפיתל הלומינלי מבודד במידה רבה מהשכבה הבסיסית הבסיסית, המופרדת עוד יותר מהסטרומה על ידי קרום המרתף, הזרקה אינטרדוקטלית מגבילה את הזיהום בעיקר לתאי אפיתל לומינליים, התא העיקרי של מוצא סרטן השד. בתוך שכבת אפיתל לומינלית זו, ישנם גם תת-סוגים שונים של תאים, כולל תאי גזע, תאי אב וכמה קבוצות של תאים ממוינים. כדי להדביק תת-קבוצות תאים ספציפיות באוכלוסיית התאים הלומינליים, ניתן להשתמש בטכנולוגיית TVA, שבה וקטורים RCAS^5,10 שמקורם בנגיף לויקוזיס העופות או וקטורים לנטי-ויראליים פסאודו-טיפיים¹¹ מדביקים באופן סלקטיבי את התאים המבטאים TVA בעכברים הנושאים טרנסגן TVA תחת שליטתו של מקדם ספציפי לסוג התא, כגון מקדם הפעיל רק בתאי גזע 6 או אבות מסוימים ^{6, 7} או תאים מכתשית⁸ או תאים פעילים במסלול Wnt⁹.

פרוטוקול זה מציג את הטכניקה של החדרת גנים מעניינים לתאי אפיתל חלב באמצעות הזרקה intraductal של וקטור נגיפי. לאחר מכן מודגם זיהוי הביטוי של הגנים שהוכנסו והנגעים ההיפרפלסטיים והגידולים המתקבלים.

Protocol

כל ההליכים באמצעות עכברים בוצעו בהתאם לפרוטוקול בעל חיים שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בנקבות FVB/N או MMTV-tva בנות 9-12 שבועות. העכברים הושגו באופן מסחרי או בייצור עצמי (ראו טבלת חומרים). נעשה שימוש בנגיפים Lenti-EGFP (FUCGW) ו-RCAS-Erbb2 (Neu). הכנת הנגיף וקביעת הטיטר בוצעו בעקבות הדוחות שפורסמו בעבר^10,12.

1. הכנת מזרק

1. חתכו את מחטי רכזת המתכת 33 G (ראו טבלת חומרים) לאורך של כ-1 ס"מ. לאחסן את המחטים ואת מזרק 50 μL ב 70% אלכוהול לאחר autoclaving.
2. מוציאים מזרקים ומחטים מהאלכוהול. הוציאו את שארית האלכוהול מהמזרק והמחט. יש לפרק את המזרק לייבוש באוויר על כרית ספסל סופגת אוטוקלאבית.
3. מרכיבים את המזרק לאחר הייבוש.

2. הכנת וירוסים

1. הוציאו צינורית ויראלית אחת או יותר לפי הצורך מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C והפשירו את הנגיף על קרח.
   הערה: בהתאם למספר התאים שיש להדביק, ייתכן שיהיה צורך לדלל את הנגיף לטיטרים מיועדים באמצעות PBS 1x בשלב זה.
2. הוסיפו ברומופנול כחול על ידי טבילת קצה פיפטה לעומק של 1 ס"מ באבקת ברומופנול כחולה (ראו טבלת חומרים). לאחר מכן, הביאו את כמות העקבות המצורפת של ברומופנול כחול לתרחיף הנגיף.
   הערה: במחקר הנוכחי, המלאי הנגיפי הוא בדרך כלל 200 מיקרוליטר לכל צינור, כך שריכוז הצבע הסופי הוא כ -0.2% (0.2 מיקרוגרם / 100 מיקרוליטר). ברומופנול כחול צריך להיות מעוקר עם קרינת מיקרוגל במשך 45 שניות בהספק גבוה של 1250 W (ראה טבלת חומרים). הקפד לבצע את כל ההליך בסביבה סטרילית.
3. מערבבים את כחול הברומופנול עם תמיסת הנגיף על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים.
4. מניחים את הנגיף על קרח ומביאים את דלי הקרח לוויבריום.

3. הכנת בעלי חיים

1. הרדימו עכברה נקבה על ידי הזרקה תוך צפקית של 2 μL/g של חומר הרדמה (37.6 מ"ג/מ"ל קטמין, 1.92 מ"ג/מ"ל קסילזין ו-0.38 מ"ג/מ"ל אצפרומזין, ראו טבלת חומרים). בדוק את עומק ההרדמה עם צביטת בוהן. יש למרוח משחה על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
   הערה: העכבר חייב להיות לא מגיב לצביטה בבוהן תחת הרדמה טובה. ניתן להשתמש באיזופלורן גם כדי להרדים את העכברים.
2. הניחו את העכבר במצב שכיבה על כרית חמה וחברו את כל ארבעת הגפיים לספסל באמצעות סרט הדבקה.
3. זהה פטמה אחת (או יותר) להזרקה (מספר 4 מועדף למחקר הנוכחי). חשוף אותו על ידי גזיזת השיער שמסביב באמצעות זוג מספריים.
4. יש למרוח 70% אלכוהול ומקלוני יודופור על אזור הפטמה בשלושה סיבובים כדי לנקות ולחשוף את הפטמה.

4. הזרקה intraductal של וירוס

הערה: ניתן להשתמש במנורה מגדלת כדי לסייע בהדמיה של פתח הפטמה.

1. חצו את הקצה הדיסטלי של פטמה באמצעות זוג מספריים קפיציים סטריליים של מיקרודיסקציה, עד שניתן לראות פתח צינור מרכזי קטן מתחת למנורת זכוכית מגדלת (ראו טבלת חומרים).
2. יש להעמיס 10 מיקרוליטר של תערובת וירוס/ברומופנול כחול לתוך המזרק.
   הערה: Lenti-EGFP (FUCGW) ו- RCAS-Erbb2 (Neu) משמשים בהדגמה זו.
3. הכנס בזהירות את המחט לפתח הפטמה בעזרת מנורת הזכוכית המגדלת. כיוון המחט מותאם מעט מהמדיאלי לצדדי כדי ליישר קו עם הצינור הראשי.
4. הזריקו את כל 10 μL של הנגיף לתוך עץ הצינור.
   הערה: הצינורות מתחת לעור צריכים להפוך כחולים, אם ההזרקה מוצלחת. כל התנגדות או מראה של שינוי צבע מקומי מציין את כישלון ההזרקה.
5. הנח את העכבר על מגלשה חמה יותר להגדיר על 45 ° C עד העכבר מתעורר לחלוטין (~ 30-60 דקות).

5. איתור תאים נגועים על ידי סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי

1. שלושה עד חמישה ימים לאחר הזרקת הנגיף הנושא GFP או גנים פלואורסצנטיים אחרים, יש להרדים את העכבר על ידי מינון יתר שלו עם 4 uL/g של חומר הרדמה (37.6 מ"ג/מ"ל קטמין, 1.92 מ"ג/מ"ל קסילזין ו-0.38 מ"ג/מ"ל אצפרומזין).
2. פתח את חלל בית החזה. חותכים את העור לאורך קו האמצע הגחוני ולאורך הגפיים העליונות והתחתונות באמצעות זוג מספריים. להרים את העור ולחשוף את בלוטות החלב.
3. הסר את בלוטת החלב המוזרקת מהעור באמצעות זוג מלקחיים ומספריים. כמו כן, הסר בלוטה שלא הוזרקה כבקרה.
4. מניחים את בלוטות החלב על מגלשות זכוכית ופורשים את הבלוטות לצורתן המקורית.
5. התבוננו ודמיינו את הבלוטות תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

נתונים מייצגים מוצגים כאן כדי להדגים הזרקה אינטרדוקטלית מוצלחת, זיהום ויראלי מוצלח, ואת ההשפעה של הגנים המועברים על גידולי החלב. כמות הנגיף המוזרק חייבת להיות מותאמת למטרת כל ניסוי. כדי להמחיש עד כמה עץ צינור החלב יכול להיות נגוע, יש להשתמש בכמות גדולה של גנים נושאי וירוסים שניתן לצלם, כגו?...

Discussion

מאמר זה מדגים את טכניקת ההזרקה התוך-צינורית הנגיפית להחדרת גנים לתאי אפיתל חלב של עכברים לצורך מידול סרטן שד ספורדי. בדרך כלל, עכברים של לפחות 5 שבועות ומעלה מוזרקים כך התהליך האונקוגני מתחיל לאחר התפתחות בלוטת החלב. חוץ מזה, פתח הפטמה של עכברים מתחת לגיל 5 שבועות הוא לעתים קרובות קטן מדי לה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-HA antibody	Covance	MMS-101P	Dilution: 1 : 1000
Artificial Tears	Covetrus	NDC 11695-0832-1
Bromophenol blue	Sigma	B5525	microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven
FACSCantoII	BD Biosciences	V96100899
Fluorescent stereomicroscope	Leica	MZ16 FA
FUCGW lenti-virus	Self-made	N/A	See reference # 12
FVB/N	The Jackson Laboratory	JAX:001800
Hamilton needle	Hamilton	91033	autoclaved
Hamilton syringe	Hamilton	201000	autoclaved
LED magnifying lamp	Intertek	3165273
Micro dissection spring scissor	Roboz	RS-5621	autoclaved
MMTV-tva	Self-made		See reference # 10
RCAS-Neu (HA)	Self-made	N/A	See reference # 10
Rodent Comboanesthetic III	Veterinary Pharmacy	Veterinary prescription	37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine