İn Vivo Meme İntraduktal Enjeksiyon Yoluyla Fare Meme Epitel Hücrelerine Gen İletimi

Özet

Bu protokol, ilgilenilen genleri meme epitel hücrelerine iletmek için meme ucu yoluyla viral vektörlerin intraduktal enjeksiyonunu tanımlamaktadır.

Özet

Fare meme bezleri, epitel hücreleri tarafından kaplanmış ve her meme ucunun ucunda bir açıklığa sahip olan duktal ağaçlardan oluşur. Epitel hücreleri meme bezi fonksiyonunda önemli bir rol oynar ve çoğu meme tümörünün kökenidir. İlgilenilen genlerin fare meme epitel hücrelerine tanıtılması, epitel hücrelerinde gen fonksiyonunun değerlendirilmesinde ve fare meme tümörü modellerinin oluşturulmasında kritik bir adımdır. Bu hedef, ilgilenilen genleri fare meme duktal ağacına taşıyan viral bir vektörün intraduktal enjeksiyonu ile gerçekleştirilebilir. Enjekte edilen virüs daha sonra meme epitel hücrelerini enfekte eder ve ilgilenilen genleri getirir. Viral vektör lentiviral, retroviral, adenoviral veya adenovirüs ilişkili viral (AAV) olabilir. Bu çalışma, ilgilenilen bir genin, viral bir vektörün fare meme intraduktal enjeksiyonu yoluyla meme epitel hücrelerine nasıl verildiğini göstermektedir. GFP taşıyan bir lentivirüs, verilen bir genin stabil ekspresyonunu göstermek için kullanılır ve onkogen kaynaklı atipik hiperplastik lezyonları ve meme tümörlerini göstermek için Erbb2 (HER2 / Neu) taşıyan bir retrovirüs kullanılır.

Giriş

Meme bezlerinin epitel hücreleri, bu bezlerin işlevinde önemli bir rol oynar ve meme kanserinin ana menşe hücresidir. Meme bezi biyolojisi ve tümörigenez çalışmaları sıklıkla bu hücrelere ilgi çekici genlerin verilmesini gerektirir. Her fare meme bezi, meme ucunun ucunda tek bir açıklığa sahip epitel hücreleri tarafından kaplanmış bir duktal ağaçtan oluşur. Bu yapı, meme epitel hücrelerini, intraduktal enjeksiyon¹ yoluyla bir duktal ağacın lümenine verilebilen viral vektörlere kolayca erişilebilir hale getirir.

Meme intraduktal enjeksiyon tekniği başlangıçta keçi, tavşan ve sıçan gibi çok daha büyük hayvanlar için kullanılmıştır¹. Fareler gibi çok daha küçük bir hayvan için, intraduktal enjeksiyon birçok hassas alete ve operatörlerin daha fazla uygulamasına ihtiyaç duyar. Fare intraduktal enjeksiyonu için iki yaklaşım vardır. Biri meme ucu enjeksiyonu^1'dir. Bir diğeri, cerrahi maruziyetten sonra # 3 veya # 4 meme bezinin birincil kanalının doğrudan enjeksiyonudur¹. Birincisi, operatör iyi eğitildikten sonra non-invaziv ve daha hızlı olduğundan, bu teknik daha yaygın olarak kullanılmaktadır ve bu makalede ayrıntılı olarak açıklanacaktır.

İlgilenilen genin mikroenjeksiyon yoluyla döllenmiş yumurtalar aşamasında tanıtıldığı yaygın olarak kullanılan geleneksel transgenik fare modelleriyle karşılaştırıldığında ^2,3,4, intraduktal virüs enjeksiyon yöntemiyle gen dağıtımının aşağıdakiler de dahil olmak üzere birçok avantajı vardır: (1) ilgilenilen her gen için transgenik bir fare çizgisi yapmanın zaman alıcı sürecinden kaçınır; (2) ilgili gen tarafından dayatılan meme bezlerinin normal gelişimi üzerindeki potansiyel bozulmayı önler; (3) İlgilenilen geni doğumdan sonra istenen herhangi bir zamanda tanıtır; (4) birden fazla ilgili geni kolayca birlikte tanıtabilir; (5) doğal tümörojenik süreci daha iyi taklit eder, çünkü enfekte olmuş ve dolayısıyla onkogen taşıyan hücreler normal hücrelerle çevrilidir; ve (6) TVA (tümör virüsü A, bir kuş hücre yüzey proteini ve retrovirüs RCAS vektörü için reseptör) teknolojisi⁵ ile kombinasyon halinde, ilgili gen, tümörigenezin hücre kökenini incelemek ve meme bezlerinde hücre soy izleme testleri yapmak için belirli bir hücre popülasyonuna sokulabilir 6,7,8^{, 9}.

Retrovirüs 10, lentivirüs^11,12, adenovirüs 13 ve adenovirüs ilişkili virüs (AAV) ^14'ten türetilen herhangi bir vektör^, genetik materyallerin intraduktal dağıtımı için kullanılabilir. Retrovirüs ve lentivirüs vektörleri konakçı genomuna kalıcı olarak entegre olur; Böylece, ilgilenilen genleri meme epitel hücrelerine istikrarlı bir şekilde sokarlar. Lentivirüs, karşılaştığı herhangi bir hücrenin genomuna entegre olabilirken,¹⁵, retrovirüsün etkili genomik entegrasyonu, hedef hücrelerin çoğalmasına ihtiyaç duyar¹⁶. Adenoviral ve AAV vektörleri, enfekte olmuş hücrelerin genomuna entegre olmaz ve bu nedenle, sadece geçici olarak ilgilenilen geni eksprese eder^17,18. Bu özellik, ilgili genin, flokslu bir tümör baskılayıcı genin silinmesi için Cre gibi kısa bir süre için ifade edilmesi gerektiğinde bir avantaj olabilir.

Lentivirüs, adenovirüs ve AAV, karşılaştıkları fare hücrelerini enfekte eder. Ancak luminal epitel, bazal membran tarafından stromadan daha da ayrılan altta yatan bazal tabakadan büyük ölçüde izole edildiğinden, intraduktal enjeksiyon, enfeksiyonu büyük ölçüde meme kanserinin birincil hücresi olan luminal epitel hücrelerine sınırlar. Bu luminal epitel tabakası içinde, kök hücreler, progenitör hücreler ve birkaç farklılaşmış hücre grubu dahil olmak üzere farklı hücre alt tipleri de vardır. Luminal hücre popülasyonu içindeki spesifik hücre alt kümelerini enfekte etmek için, kuş lökoz virüsü türevi RCAS vektörleri ^5,10 veya psödotiplenmiş lentiviral vektörler^11'in, sadece kök hücrelerde aktif olan bir promotör 6 veya belirli progenitörlerde^aktif olan bir promotör gibi hücre tipine özgü bir promotörün kontrolü altında bir tva transgeni taşıyan farelerde TVA'yı eksprese eden hücreleri seçici olarak enfekte ettiği TVA teknolojisi kullanılabilir^{. 7} veya alveolar hücreler⁸ veya Wnt yolu aktif hücreler⁹.

Bu protokol, bir viral vektörün intraduktal enjeksiyonu yoluyla meme epitel hücrelerine ilgili genlerin sokulması tekniğini sunar. Tanıtılan genlerin ekspresyonunun ve bunun sonucunda ortaya çıkan hiperplastik lezyonların ve tümörlerin tespiti daha sonra gösterilmiştir.

Protokol

Farelerin kullanıldığı tüm prosedürler, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onaylı hayvan protokolüne uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada 9-12 haftalık FVB/N veya MMTV-tva dişi fareler kullanıldı. Fareler ticari olarak veya kendi kendine elde edildi (bakınız Malzeme Tablosu). Lenti-EGFP (FUCGW) ve RCAS-Erbb2 (Neu) virüsleri kullanıldı. Virüs hazırlığı ve titre tayini, daha önce yayınlanan^10,12 raporlarını takiben gerçekleştirilmiştir.

1. Şırınga hazırlama

1. 33 G metal göbek iğnelerini ( bakınız Malzeme Tablosu) yaklaşık 1 cm uzunluğa kadar kesin. İğneleri ve 50 μL şırıngayı otoklavlamadan sonra% 70 alkolde saklayın.
2. Şırıngaları ve iğneleri alkolden çıkarın. Kalan alkolü şırıngadan ve iğneden dışarı itin. Şırıngayı otoklavlanmış emici bir tezgah pedi üzerinde hava kurutması için sökün.
3. Şırıngayı kuruduktan sonra monte edin.

2. Virüs hazırlığı

1. -80 ° C dondurucudan gerektiğinde bir veya birkaç viral stok tüpünü çıkarın ve virüsü buz üzerinde çözün.
   NOT: Enfekte edilecek hücre sayısına bağlı olarak, virüsün şu anda 1x PBS kullanılarak amaçlanan titrelere seyreltilmesi gerekebilir.
2. Pipet ucunu bromofenol mavisi tozuna 1 cm derinliğe kadar daldırarak bromofenol mavisi ekleyin ( bkz. Ardından, ekli eser miktarda bromofenol mavisini virüs süspansiyonuna getirin.
   NOT: Bu çalışma için, viral stok genellikle tüp başına 200 μL'dir, bu nedenle nihai boya konsantrasyonu yaklaşık% 0.2'dir (0.2 μg / 100 μL). Bromofenol mavisi, 1250 W yüksek güçte 45 saniye boyunca mikrodalga radyasyonu ile sterilize edilmelidir (bkz. Tüm prosedürü steril bir ortamda taşıdığınızdan emin olun.
3. Bromofenol mavisini 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek virüs çözeltisiyle karıştırın.
4. Virüsü buzun üzerine yerleştirin ve buz kovasını vivaryuma getirin.

3. Hayvan hazırlama

1. Bir dişi fareyi 2 μL / g anestezik intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezi yapın (37.6 mg / mL ketamin, 1.92 mg / mL ksilazin ve 0.38 mg / mL asepromazin , bkz. Bir ayak parmağı tutamağı ile anestezi derinliğini kontrol edin. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere merhem sürün.
   NOT: Fare, iyi bir anestezi altında ayak parmağının sıkışmasına yanıt vermemelidir. İzofluran ayrıca fareleri uyuşturmak için de kullanılabilir.
2. Fareyi sıcak bir ped üzerinde sırtüstü pozisyona getirin ve yapışkan bant kullanarak dört uzuvun tümünü tezgaha takın.
3. Enjekte edilecek bir meme ucunu (veya daha fazlasını) tanımlayın (bu çalışma için 4 numara tercih edilir). Bir çift makas kullanarak çevredeki saçları keserek açığa çıkarın.
4. Meme ucunu temizlemek ve açığa çıkarmak için meme başı bölgesine üç tur halinde% 70 alkol ve iyodofor çubukları uygulayın.

4. İntraduktal virüs enjeksiyonu

NOT: Meme ucu açıklığını görselleştirmeye yardımcı olmak için bir büyüteç lambası kullanılabilir.

1. Bir çift steril mikrodiseksiyon yay makası kullanarak meme ucunun distal ucunu, bir büyüteç lambasının altında küçük bir merkezi duktal açıklık görülene kadar transekte edin (bkz.
2. Şırıngaya 10 μL virüs/bromofenol mavisi karışımı yükleyin.
   NOT: Bu gösterimde Lenti-EGFP (FUCGW) ve RCAS-Erbb2 (Neu) kullanılmıştır.
3. İğneyi büyüteç lambasının yardımıyla meme ucu açıklığına dikkatlice yerleştirin. İğnenin oryantasyonu, ana kanalla hizalanmak için medialden laterale hafifçe ayarlanır.
4. Virüsün 10 μL'sinin tamamını kanal ağacına enjekte edin.
   NOT: Enjeksiyon başarılı olursa, cildin altındaki kanallar maviye dönmelidir. Herhangi bir direnç veya lokalize bir renk değişiminin ortaya çıkması, enjeksiyonun başarısızlığını gösterir.
5. Fare tamamen uyanana kadar (~ 30-60 dakika) fareyi 45 ° C'de ayarlanmış bir slayt ısıtıcısına koyun.

5. Enfekte hücrelerin floresan stereomikroskop ile tespiti

1. GFP veya diğer floresan genleri taşıyan virüsün enjeksiyonundan üç ila beş gün sonra, fareyi 4 uL / g anestezik (37.6 mg / mL ketamin, 1.92 mg / mL ksilazin ve 0.38 mg / mL asepromazin) ile aşırı dozlayarak ötenazi yapın.
2. Göğüs boşluğunu açın. Cildi ventral orta çizgi boyunca ve bir çift makas kullanarak üst ve alt ekstremiteler boyunca kesin. Cildi kaldırın ve meme bezlerini açığa çıkarın.
3. Enjekte edilen meme bezini bir çift forseps ve makas kullanarak deriden çıkarın. Ayrıca, enjekte edilmemiş bir bezi kontrol olarak çıkarın.
4. Meme bezlerini cam slaytlara yerleştirin ve bezleri orijinal şekillerine yayın.
5. Bezleri floresan stereomikroskop altında gözlemleyin ve görüntüleyin.

Sonuçlar

Burada başarılı intraduktal enjeksiyon, başarılı viral enfeksiyon ve verilen genlerin meme tümörigenezi üzerindeki etkisini göstermek için temsili veriler sunulmuştur. Enjekte edilen virüs miktarı, her deneyin amacına göre uyarlanmalıdır. Meme kanalı ağacının ne kadar yaygın bir şekilde enfekte olabileceğini göstermek için, GFP gibi görüntülenebilen çok miktarda virüs taşıyan genin kullanılması gerekir. Öte yandan, doğal spontan tümörigenezi taklit etmek için, bir onkogen taşıya...

Tartışmalar

Bu makalede, sporadik meme kanserini modellemek için fare meme epitel hücrelerine genleri sokmak için viral intraduktal enjeksiyon tekniği gösterilmektedir. Genellikle, en az 5 hafta veya daha büyük farelere enjekte edilir, böylece onkojenik süreç meme bezi geliştikten sonra başlar. Ayrıca, 5 haftalıktan küçük farelerin meme ucu açıklığı genellikle enjeksiyon için çok küçüktür. Öte yandan, çok yaşlı farelerin meme uçları bazen dejenere olur ve transeksiyon duktal bir açıklığı ortaya...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-HA antibody	Covance	MMS-101P	Dilution: 1 : 1000
Artificial Tears	Covetrus	NDC 11695-0832-1
Bromophenol blue	Sigma	B5525	microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven
FACSCantoII	BD Biosciences	V96100899
Fluorescent stereomicroscope	Leica	MZ16 FA
FUCGW lenti-virus	Self-made	N/A	See reference # 12
FVB/N	The Jackson Laboratory	JAX:001800
Hamilton needle	Hamilton	91033	autoclaved
Hamilton syringe	Hamilton	201000	autoclaved
LED magnifying lamp	Intertek	3165273
Micro dissection spring scissor	Roboz	RS-5621	autoclaved
MMTV-tva	Self-made		See reference # 10
RCAS-Neu (HA)	Self-made	N/A	See reference # 10
Rodent Comboanesthetic III	Veterinary Pharmacy	Veterinary prescription	37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine