体内 通过乳腺导管内注射将基因传递到小鼠乳腺上皮细胞

摘要

本协议描述了通过 在 导管内注射病毒载体以将感兴趣的基因递送到乳腺上皮细胞中。

摘要

小鼠乳腺由导管树组成，导管树由上皮细胞衬里，每个的尖端都有一个开口。上皮细胞在乳腺功能中起主要作用，是大多数乳腺肿瘤的起源。将感兴趣的基因引入小鼠乳腺上皮细胞是评估上皮细胞基因功能和生成小鼠乳腺肿瘤模型的关键步骤。该目标可以通过在导管内注射携带目标基因的病毒载体到小鼠乳腺导管树中来实现。注射的病毒随后感染乳腺上皮细胞，带来感兴趣的基因。病毒载体可以是慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或腺病毒相关病毒 （AAV）。这项研究证明了目的基因如何通过小鼠乳腺导管内注射病毒载体递送到乳腺上皮细胞中。携带 GFP 的慢病毒用于显示递送基因的稳定表达，携带 Erbb2 （HER2 / Neu）的逆转录病毒用于显示癌基因诱导的非典型增生病变和乳腺肿瘤。

引言

乳腺的上皮细胞在这些腺体的功能中起着重要作用，是乳腺癌的主要起源细胞。乳腺生物学和肿瘤发生的研究经常需要将感兴趣的基因递送到这些细胞中。每个小鼠乳腺包括一棵由上皮细胞衬里的导管树，顶端有一个开口。这种结构使乳腺上皮细胞易于被病毒载体接近，病毒载体可以通过导管^内注射传递到导管树的腔内1。

乳腺导管内注射技术最初用于更大的动物，如山羊、兔子和大鼠¹。对于像小鼠这样小得多的动物，导管内注射需要许多精密的工具和操作人员的更多实践。小鼠导管内注射有两种方法。一种是注射¹。另一种是在手术暴露后直接注射#3或#4乳腺的初级导管¹。由于第一种是非侵入性的，一旦操作员经过良好的培训，就会更快，因此这种技术更常用，本文将详细描述。

与广泛使用的传统转基因小鼠模型相比，在受精卵阶段通过显微注射²，³，⁴引入目的基因，通过导管内病毒注射方法传递基因具有许多优点^，包括:（1）避免了为每个目的基因制作转基因小鼠系的耗时过程;（2）避免目的基因对乳腺正常发育的潜在损害;（3）它在出生后的任何期望时间引入目的基因;（4）它可以很容易地共同引入一个以上的目的基因;（5）它更好地模仿了自然致瘤过程，因为感染的细胞和携带癌基因的细胞被正常细胞包围;（6）结合TVA（肿瘤病毒A，一种禽细胞表面蛋白和逆转录病毒RCAS载体的受体）技术⁵，可以将目的基因引入特定的细胞群中，以研究肿瘤发生的细胞起源并在乳腺⁶，⁷，⁸中进行细胞谱系追踪测定^，9.

任何来源于逆转录病毒 10、慢病毒 11、12^、腺病毒 13 和腺病毒相关病毒 （AAV）¹⁴ 的载体都可用于导管内递送遗传物质。逆转录病毒和慢病毒载体永久整合到宿主基因组中;因此，它们将感兴趣的基因稳定地引入乳腺上皮细胞。虽然慢病毒可以整合到它遇到的任何细胞的基因组中¹⁵，但逆转录病毒的有效基因组整合需要靶细胞的增殖¹⁶。腺病毒和AAV载体不整合到感染细胞的基因组中，因此仅瞬时表达目的基因^17，18。当目的基因只需要表达很短的时间（例如Cre）以删除絮状肿瘤抑制基因时，此功能可能是一个优势。

慢病毒、腺病毒和AAV感染它们遇到的任何小鼠细胞。但是，由于管腔上皮在很大程度上与下面的基底层绝缘，基底层通过基底膜与基质进一步分离，因此导管内注射将感染主要限制在管腔上皮细胞，这是乳腺癌起源的主要细胞。在这个管腔上皮层内，也有不同的细胞亚型，包括干细胞、祖细胞和几组分化细胞。为了感染管腔细胞群中的特定细胞亚群，可以使用TVA技术，其中禽白血病病毒衍生的RCAS载体⁵，¹⁰或假型慢病毒载体¹¹选择性地感染在细胞类型特异性启动子控制下携带TVA转基因的小鼠中表达TVA的细胞，例如仅在干细胞6或某些^祖细胞6中活跃的启动子^6，肺泡细胞7或Wnt通路活性细胞8或Wnt通路^{活性细胞9}。

该协议介绍了通过导管内注射病毒载体将感兴趣的基因引入乳腺上皮细胞的技术。然后证明引入基因的表达以及由此产生的增生病变和肿瘤的检测。

研究方案

所有使用小鼠的程序均按照机构动物护理和使用委员会批准的动物方案进行。在本研究中，使用9-12周龄的FVB / N或MMTV-tva 雌性小鼠。小鼠是商业或自制的（见 材料表）。使用Lenti-EGFP （FUCGW）和RCAS-Erbb2（Neu） 病毒。按照先前发表的报告^10，12进行病毒制备和滴度测定。

1. 注射器准备

1. 将 33 G 金属轮毂针（见 材料表）切割成约 1 厘米长。高压灭菌后，将针头和 50 μL 注射器储存在 70% 酒精中。
2. 从酒精中取出注射器和针头。将剩余的酒精从注射器和针头中推出。拆卸注射器在高压灭菌的吸收剂工作台垫上进行空气干燥。
3. 干燥后组装注射器。

2. 病毒制备

1. 根据需要从-80°C冰箱中取出一个或几个病毒储备管，并在冰上解冻病毒。
   注意:根据要感染的细胞数量，此时可能需要使用1x PBS将病毒稀释成预期的滴度。
2. 通过将移液器吸头浸入溴酚蓝粉末中1厘米的深度来添加溴酚蓝（参见 材料表）。然后，将附着的微量溴酚蓝带入病毒悬浮液中。
   注意:对于本研究，病毒原液通常为每管 200 μL，因此最终染料浓度约为 0.2% （0.2 μg/100 μL）。溴酚蓝应用微波辐射以1250 W的高功率灭菌45秒（见材料表）。确保在无菌环境中进行整个过程。
3. 通过上下移液10次将溴酚蓝与病毒溶液混合。
4. 将病毒放在冰上，然后将冰桶带到动物饲养室。

3. 动物制备

1. 通过腹膜内注射2μL / g麻醉剂（37.6mg / mL氯胺酮，1.92mg / mL甲苯噻嗪和0.38mg / mL乙酰丙嗪，参见 材料表）麻醉雌性小鼠。用脚趾捏住检查麻醉深度。在麻醉下将软膏涂抹在眼睛上以防止干燥。
   注意:在良好的麻醉下，鼠标必须对脚趾捏没有反应。异氟醚也可用于麻醉小鼠。
2. 将鼠标仰卧放在温暖的垫子上，并使用胶带将所有四肢连接到工作台上。
3. 确定要注射的一个（或多个）（本研究首选数字4）。用一把剪刀修剪周围的头发，露出它。
4. 将 70% 的酒精和碘伏棉签分三轮涂抹在区域，以清洁并暴露。

4.导管内注射病毒

注意:可以使用放大灯来帮助观察开口。

1. 使用一对无菌显微切割弹簧剪刀横断的远端尖端，直到在放大镜灯下可以看到一个小的中央导管开口（见 材料表）。
2. 将 10 μL 病毒/溴酚蓝混合物加载到注射器中。
   注意:本演示中使用了Lenti-EGFP（FUCGW）和RCAS-Erbb2（Neu）。
3. 在放大镜灯的帮助下，小心地将针头插入开口。针的方向从内侧到外侧略微调整，以与主导管对齐。
4. 将整个 10 μL 病毒注入导管树中。
   注意:如果注射成功，皮下的导管应该变成蓝色。任何阻力或局部颜色变化的出现都表明注射失败。
5. 将鼠标放在设置在45°C的载玻片加热器上，直到鼠标完全唤醒（~30-60分钟）。

5. 用荧光体视显微镜检测感染细胞

1. 注射携带GFP或其他荧光基因的病毒后三到五天，通过过量服用4uL / g麻醉剂（37.6mg / mL氯胺酮，1.92mg / mL甲苯噻嗪和0.38mg / mL乙酰丙嗪）来对小鼠实施安乐死。
2. 打开胸腔。用一把剪刀沿着腹侧中线和上下肢切割皮肤。提起皮肤，露出乳腺。
3. 使用一把镊子和剪刀从皮肤上取出注射的乳腺。此外，取出未注射的腺体作为对照。
4. 将乳腺放在载玻片上，并将腺体铺展到原来的形状。
5. 在荧光体视显微镜下观察腺体并成像。

结果

这里提供的代表性数据是为了证明成功的导管内注射、成功的病毒感染以及递送的基因对乳腺肿瘤发生的影响。注射的病毒量必须根据每个实验的目的进行调整。为了说明乳腺导管树被感染的程度，需要使用大量可以成像的携带病毒的基因，例如GFP。另一方面，为了模仿自然自发的肿瘤发生，必须使用少量携带癌基因的病毒，以便只有少数细胞被感染，并在原本完全正常的乳腺领域进化为癌前病?...

讨论

本文展示了将基因引入小鼠乳腺上皮细胞以模拟散发性乳腺癌的病毒导管内注射技术。通常，注射至少5周或更大的小鼠，以便在乳腺发育后开始致癌过程。此外，5周龄以下小鼠的开口通常太小而无法注射。另一方面，非常老的小鼠的有时会退化，横断可能无法揭示导管开口。同样重要的是要注意，由于种系基因突变引起的异常乳腺发育，一些转基因或敲除肿瘤模型的也可能难以注射。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-HA antibody	Covance	MMS-101P	Dilution: 1 : 1000
Artificial Tears	Covetrus	NDC 11695-0832-1
Bromophenol blue	Sigma	B5525	microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven
FACSCantoII	BD Biosciences	V96100899
Fluorescent stereomicroscope	Leica	MZ16 FA
FUCGW lenti-virus	Self-made	N/A	See reference # 12
FVB/N	The Jackson Laboratory	JAX:001800
Hamilton needle	Hamilton	91033	autoclaved
Hamilton syringe	Hamilton	201000	autoclaved
LED magnifying lamp	Intertek	3165273
Micro dissection spring scissor	Roboz	RS-5621	autoclaved
MMTV-tva	Self-made		See reference # 10
RCAS-Neu (HA)	Self-made	N/A	See reference # 10
Rodent Comboanesthetic III	Veterinary Pharmacy	Veterinary prescription	37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine