In vivo Entrega de genes en células epiteliales mamarias de ratón a través de inyección intraductal mamaria

Resumen

El presente protocolo describe la inyección intraductal de vectores virales a través de la tetina para administrar genes de interés en las células epiteliales mamarias.

Resumen

Las glándulas mamarias del ratón comprenden árboles ductales, que están revestidos por células epiteliales y tienen una abertura en la punta de cada pezón. Las células epiteliales juegan un papel importante en la función de la glándula mamaria y son el origen de la mayoría de los tumores mamarios. La introducción de genes de interés en células epiteliales mamarias de ratón es un paso crítico en la evaluación de la función génica en las células epiteliales y la generación de modelos de tumores mamarios de ratón. Este objetivo se puede lograr a través de la inyección intraductal de un vector viral que lleva los genes de interés en el árbol ductal mamario del ratón. El virus inyectado posteriormente infecta las células epiteliales mamarias, trayendo los genes de interés. El vector viral puede ser lentiviral, retroviral, adenoviral o viral asociado a adenovirus (AAV). Este estudio demuestra cómo un gen de interés se administra en las células epiteliales mamarias a través de la inyección intraductal mamaria de ratón de un vector viral. Un lentivirus portador de GFP se utiliza para mostrar la expresión estable de un gen entregado, y un retrovirus portador de Erbb2 (HER2/Neu) se utiliza para demostrar lesiones hiperplásicas atípicas inducidas por oncogén y tumores mamarios.

Introducción

Las células epiteliales de las glándulas mamarias juegan un papel importante en la función de estas glándulas y son la principal célula de origen del cáncer de mama. Los estudios de la biología de las glándulas mamarias y la tumorigénesis con frecuencia necesitan la entrega de genes de interés en estas células. Cada glándula mamaria de ratón comprende un árbol ductal revestido por células epiteliales con una sola abertura en la punta del pezón. Esta estructura hace que las células epiteliales mamarias sean fácilmente accesibles para los vectores virales, que pueden ser entregados en la luz de un árbol ductal a través de la inyección intraductal¹.

La técnica de inyección intraductal mamaria se utilizó originalmente para animales mucho más grandes como cabras, conejos y ratas¹. Para un animal mucho más pequeño como los ratones, la inyección intraductal necesita muchas herramientas delicadas y más prácticas de los operadores. Existen dos enfoques para la inyección intraductal en ratones. Una es la inyección hasta la tetina¹. Otra es la inyección directa del conducto primario de la glándula mamaria #3 o #4 después de la exposición quirúrgica¹. Dado que la primera es no invasiva y más rápida una vez que el operador ha sido bien entrenado, esta técnica se usa más comúnmente y se describirá en detalle en este artículo.

En comparación con los modelos tradicionales de ratón transgénico ampliamente utilizados, en los que el gen de interés se introduce en la etapa de óvulos fertilizados a través de microinyección ^2,3,4, la administración de genes a través del método de inyección intraductal de virus tiene muchas ventajas, que incluyen: (1) evita el proceso lento de hacer una línea de ratón transgénico para cada gen de interés; (2) evita el deterioro potencial en el desarrollo normal de las glándulas mamarias impuesto por el gen de interés; (3) introduce el gen de interés en cualquier momento deseado después del nacimiento; (4) puede cointroducir fácilmente más de un gen de interés; (5) imita mejor el proceso tumorigénico natural porque las células infectadas y, por lo tanto, portadoras de oncogenes están rodeadas por células normales; y (6) en combinación con la tecnología TVA (virus tumoral A, una proteína de la superficie celular aviar y el receptor para el vector RCAS del retrovirus)⁵, el gen de interés puede introducirse en una población celular específica para estudiar el origen celular de la tumorigénesis y realizar ensayos de rastreo del linaje celular en las glándulas mamarias ^{6,7,8, 9}.

Cualquier vector derivado del retrovirus 10, lentivirus 11,12^, adenovirus 13 y virus asociado a adenovirus (AAV)¹⁴ puede utilizarse para la administración intraductal de materiales genéticos. Los vectores de retrovirus y lentivirus se integran en el genoma del huésped de forma permanente; Por lo tanto, introducen genes de interés de manera estable en las células epiteliales mamarias. Mientras que el lentivirus puede integrarse en el genoma de cualquier célula que encuentre¹⁵, la integración genómica eficiente del retrovirus necesita la proliferación de las células diana¹⁶. Los vectores adenovirales y AAV no se integran en el genoma de las células infectadas y, por lo tanto, sólo expresan transitoriamente el gen de interés^17,18. Esta característica puede ser una ventaja cuando el gen de interés necesita expresarse solo por un corto período de tiempo, como Cre, para eliminar un gen supresor de tumores floxed.

Lentivirus, adenovirus y AAV infectan cualquier célula de ratón que encuentren. Pero dado que el epitelio luminal está aislado en gran medida de la capa basal subyacente, que está más separada del estroma por la membrana basal, la inyección intraductal limita la infección en gran medida a las células epiteliales luminales, la célula primaria de origen del cáncer de mama. Dentro de esta capa epitelial luminal, también hay distintos subtipos de células, incluidas las células madre, las células progenitoras y varios grupos de células diferenciadas. Para infectar subconjuntos celulares específicos dentro de la población de células luminales, se puede utilizar la tecnología TVA, con la que los vectores RCAS 5,10 derivados del virus de la leucosis aviar o los vectores lentivirales pseudotipados¹¹ infectan selectivamente las células que expresan TVA en ratones que portan un transgén tva bajo el control de un promotor específico del tipo celular, como un promotor que está activo solo en células madre 6 o ciertos progenitores ^{6, 7} o células alveolares⁸ o células activas de la vía Wnt⁹.

Este protocolo presenta la técnica de introducción de genes de interés en células epiteliales mamarias mediante inyección intraductal de un vector viral. A continuación, se demuestra la detección de la expresión de los genes introducidos y las lesiones hiperplásicas y tumores resultantes.

Protocolo

Todos los procedimientos con ratones se realizaron de acuerdo con el protocolo animal aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Para el presente estudio, se utilizaron ratones hembra FVB / N o MMTV-tva de 9-12 semanas de edad. Los ratones se obtuvieron comercialmente o de fabricación propia (ver Tabla de materiales). Se utilizaron los virus Lenti-EGFP (FUCGW) y RCAS-Erbb2 (Neu). La preparación del virus y la determinación del título se realizaron siguiendo los informes publicados anteriormente^10,12.

1. Preparación de la jeringa

1. Corte las agujas metálicas de 33 G (consulte la Tabla de materiales) a aproximadamente 1 cm de longitud. Guarde las agujas y la jeringa de 50 μL en alcohol al 70% después del autoclave.
2. Saque las jeringas y agujas del alcohol. Expulse el alcohol restante de la jeringa y la aguja. Desmonte la jeringa para secar al aire en una almohadilla absorbente esterilizada en autoclave.
3. Ensamble la jeringa después del secado.

2. Preparación del virus

1. Saque uno o varios tubos de material viral según sea necesario del congelador de -80 °C y descongele el virus en hielo.
   NOTA: Dependiendo del número de células a infectar, es posible que sea necesario diluir el virus en títulos previstos utilizando 1x PBS en este momento.
2. Añadir azul de bromofenol sumergiendo la punta de la pipeta a una profundidad de 1 cm en el polvo de azul de bromofenol (ver Tabla de materiales). Luego, coloque la traza adjunta de azul de bromofenol en la suspensión del virus.
   NOTA: Para el presente estudio, el stock viral suele ser de 200 μL por tubo, por lo que la concentración final de colorante es de aproximadamente 0,2% (0,2 μg/100 μL). El azul de bromofenol debe esterilizarse con radiación de microondas durante 45 segundos a una potencia alta de 1250 W (ver Tabla de materiales). Asegúrese de llevar todo el procedimiento en un ambiente estéril.
3. Mezcle el azul de bromofenol con la solución de virus pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
4. Coloque el virus en hielo y lleve el cubo de hielo al vivero.

3. Preparación animal

1. Anestesiar a una hembra de ratón mediante inyección intraperitoneal de 2 μL/g de anestésico (37,6 mg/ml de ketamina, 1,92 mg/ml de xilazina y 0,38 mg/ml de acepromazina, ver Tabla de materiales). Verifique la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie. Aplique ungüento en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
   NOTA: El ratón no debe responder al pellizco del dedo del pie bajo buena anestesia. El isoflurano también se puede usar para anestesiar a los ratones.
2. Coloque el ratón en posición supina sobre una almohadilla caliente y fije las cuatro extremidades al banco con cinta adhesiva.
3. Identifique un pezón (o más) para ser inyectado (se prefiere el número 4 para el presente estudio). Exponerlo recortando el cabello circundante con un par de tijeras.
4. Aplique hisopos de alcohol y yodóforo al 70% en el área del pezón en tres rondas para limpiar y exponer el pezón.

4. Inyección intraductal del virus

NOTA: Se puede usar una lámpara de aumento para ayudar a visualizar la abertura del pezón.

1. Transecte la punta distal de un pezón usando un par de tijeras de resorte de microdisección estériles, hasta que se pueda ver una pequeña abertura ductal central debajo de una lámpara de lupa (consulte la Tabla de materiales).
2. Cargue 10 μL de mezcla de virus/azul de bromofenol en la jeringa.
   NOTA: Lenti-EGFP (FUCGW) y RCAS-Erbb2 (Neu) se utilizan en esta demostración.
3. Inserte cuidadosamente la aguja en la abertura del pezón con la ayuda de la lámpara de la lupa. La orientación de la aguja se ajusta ligeramente de medial a lateral para alinearse con el conducto principal.
4. Inyecte los 10 μL completos del virus en el árbol de conductos.
   NOTA: Los conductos debajo de la piel deben volverse azules, si la inyección es exitosa. Cualquier resistencia o la aparición de un cambio de color localizado indica el fracaso de la inyección.
5. Coloque el ratón en un calentador de diapositivas ajustado a 45 °C hasta que el ratón se despierte completamente (~30-60 min).

5. Detección de células infectadas por un estereomicroscopio fluorescente

1. De tres a cinco días después de la inyección del virus portador de GFP u otros genes fluorescentes, eutanasia al ratón sobredosificándolo con 4 uL/g de anestésico (37,6 mg/ml de ketamina, 1,92 mg/ml de xilazina y 0,38 mg/ml de acepromazina).
2. Abra la cavidad torácica. Corte la piel a lo largo de la línea media ventral y a lo largo de las extremidades superiores e inferiores con un par de tijeras. Levante la piel y exponga las glándulas mamarias.
3. Retire la glándula mamaria inyectada de la piel con un par de fórceps y tijeras. Además, retire una glándula no inyectada como control.
4. Coloque las glándulas mamarias en portaobjetos de vidrio y extienda las glándulas a su forma original.
5. Observe y obtenga imágenes de las glándulas bajo un microscopio estereoscópico fluorescente.

Resultados

Aquí se presentan datos representativos para demostrar el éxito de la inyección intraductal, la infección viral exitosa y el impacto de los genes entregados en la tumorigénesis mamaria. La cantidad de virus inyectado debe adaptarse al propósito de cada experimento. Para ilustrar cuán extensamente se puede infectar el árbol del conducto mamario, se debe usar una gran cantidad de genes portadores de virus que se pueden visualizar, como GFP. Por otro lado, para imitar la tumorigénesis espontánea natural, se debe u...

Discusión

Este artículo demuestra la técnica de inyección intraductal viral para introducir genes en células epiteliales mamarias de ratón para modelar el cáncer de mama esporádico. Por lo general, se inyectan ratones de al menos 5 semanas o más para que el proceso oncogénico comience después de que se desarrolle la glándula mamaria. Además, la abertura del pezón de ratones menores de 5 semanas de edad es a menudo demasiado pequeña para la inyección. Por otro lado, los pezones de ratones muy viejos a veces se degene...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-HA antibody	Covance	MMS-101P	Dilution: 1 : 1000
Artificial Tears	Covetrus	NDC 11695-0832-1
Bromophenol blue	Sigma	B5525	microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven
FACSCantoII	BD Biosciences	V96100899
Fluorescent stereomicroscope	Leica	MZ16 FA
FUCGW lenti-virus	Self-made	N/A	See reference # 12
FVB/N	The Jackson Laboratory	JAX:001800
Hamilton needle	Hamilton	91033	autoclaved
Hamilton syringe	Hamilton	201000	autoclaved
LED magnifying lamp	Intertek	3165273
Micro dissection spring scissor	Roboz	RS-5621	autoclaved
MMTV-tva	Self-made		See reference # 10
RCAS-Neu (HA)	Self-made	N/A	See reference # 10
Rodent Comboanesthetic III	Veterinary Pharmacy	Veterinary prescription	37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine