JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает внутрипротоковую инъекцию вирусных векторов через соску для доставки интересующих генов в эпителиальные клетки молочной железы.

Аннотация

Молочные железы мыши состоят из протоковых деревьев, которые выстланы эпителиальными клетками и имеют по одному отверстию на кончике каждого соска. Эпителиальные клетки играют важную роль в функционировании молочной железы и являются источником большинства опухолей молочной железы. Введение интересующих генов в эпителиальные клетки молочной железы мыши является важным шагом в оценке функции генов в эпителиальных клетках и создании моделей опухолей молочной железы мышей. Эта цель может быть достигнута путем внутрипротоковой инъекции вирусного вектора, несущего интересующие гены, в протоковое дерево молочной железы мыши. Введенный вирус впоследствии заражает эпителиальные клетки молочной железы, привнося интересующие гены. Вирусный вектор может быть лентивиральным, ретровирусным, аденовиральным или аденовирус-ассоциированным вирусом (AAV). Это исследование демонстрирует, как интересующий ген доставляется в эпителиальные клетки молочной железы посредством внутрипротоковой инъекции вирусного вектора в грудную клетку мыши. Лентивирус, несущий GFP , используется для демонстрации стабильной экспрессии доставленного гена, а ретровирус, несущий Erbb2 (HER2 / Neu), используется для демонстрации онкоген-индуцированных атипичных гиперпластических поражений и опухолей молочной железы.

Введение

Эпителиальные клетки молочных желез играют важную роль в функционировании этих желез и являются основной клеткой происхождения рака молочной железы. Исследования биологии молочной железы и онкогенеза часто требуют доставки интересующих генов в эти клетки. Каждая молочная железа мыши состоит из протокового дерева, выстланного эпителиальными клетками, с одним отверстием на кончике соска. Эта структура делает эпителиальные клетки молочной железы легко доступными для вирусных векторов, которые могут быть доставлены в просвет протокового дерева посредством внутрипротоковой инъекции1.

Техника внутрипротоковой инъекции молочной железы первоначально использовалась для гораздо более крупных животных, таких как козы, кролики и крысы1. Для гораздо более мелких животных, таких как мыши, внутрипротоковая инъекция требует много тонких инструментов и больше практики операторов. Существует два подхода к внутрипротоковой инъекции мышей. Одним из них является инъекция вверх по соску1. Другим является прямая инъекция в первичный проток молочной железы #3 или #4 после хирургического воздействия1. Поскольку первый является неинвазивным и более быстрым, как только оператор будет хорошо обучен, этот метод используется чаще и будет подробно описан в этой статье.

По сравнению с широко используемыми традиционными моделями трансгенных мышей, в которых интересующий ген вводится на стадии оплодотворенных яйцеклеток посредством микроинъекции 2,3,4, доставка генов с помощью метода внутрипротоковой инъекции вируса имеет много преимуществ, в том числе: (1) позволяет избежать трудоемкого процесса создания трансгенной линии мыши для каждого интересующего гена; (2) это позволяет избежать потенциального нарушения нормального развития молочных желез, вызванного интересующим геном; (3) он вводит интересующий ген в любое желаемое время после рождения; (4) он может легко вводить более одного интересующего гена; (5) он лучше имитирует естественный онкогенный процесс, потому что инфицированные и, следовательно, несущие онкоген клетки, окружены нормальными клетками; и (6) в сочетании с технологией TVA (опухолевый вирус А, поверхностный белок птичьей клетки и рецептор для ретровирусного вектораRCAS) 5 интересующий ген может быть введен в конкретную клеточную популяцию для изучения клеточного происхождения онкогенеза и для проведения анализов отслеживания клеточных линий в молочных железах 6,7,8, 9.

Любые векторы, полученные из ретровируса 10, лентивируса 11,12, аденовируса 13 и аденовирус-ассоциированного вируса (AAV)14, могут быть использованы для внутрипротоковой доставки генетических материалов. Ретровирусные и лентивирусные векторы постоянно интегрируются в геном хозяина; Таким образом, они стабильно вводят интересующие гены в эпителиальные клетки молочной железы. В то время как лентивирус может интегрироваться в геном любой клетки, с которой он сталкивается15, эффективная геномная интеграция ретровируса требует пролиферацииклеток-мишеней 16. Аденовирусные и AAV-векторы не интегрируются в геном инфицированных клеток и, следовательно, лишь временно экспрессируют интересующий ген17,18. Эта особенность может быть преимуществом, когда интересующий ген должен быть экспрессирован только в течение короткого промежутка времени, например, Cre, для удаления флоксированного гена-супрессора опухоли.

Лентивирус, аденовирус и AAV заражают любые клетки мыши, с которыми они сталкиваются. Но поскольку просветный эпителий в значительной степени изолирован от нижележащего базального слоя, который дополнительно отделен от стромы базальной мембраной, внутрипротоковая инъекция ограничивает инфекцию в основном клетками просветного эпителия, первичной клеткой происхождения рака молочной железы. В этом эпителиальном слое просвета также существуют различные подтипы клеток, включая стволовые клетки, клетки-предшественники и несколько групп дифференцированных клеток. Для заражения специфических клеточных подмножеств в популяции люминальных клеток может быть использована технология TVA, с помощью которой RCAS-векторы5,10, полученные из вируса лейкоза птиц, или псевдотипированные лентивирусные векторы 11 избирательно инфицируют клетки, экспрессирующие TVA у мышей, несущих трансген tva под контролем промотора, специфичного для клеточного типа, такого как промотор, который активен только в стволовых клетках 6 или определенных предшественниках 6, 7 или альвеолярные клетки8 или активные клетки Wnt-пути9.

В этом протоколе представлена методика введения интересующих генов в эпителиальные клетки молочной железы путем внутрипротоковой инъекции вирусного вектора. Затем демонстрируется обнаружение экспрессии введенных генов и возникающих в результате гиперпластических поражений и опухолей.

протокол

Все процедуры с использованием мышей были выполнены в соответствии с протоколом по уходу за животными, утвержденным Комитетом по уходу за животными и их использованию. Для настоящего исследования были использованы 9-12-недельные самки мышей FVB/N или MMTV-tva. Мыши были получены коммерчески или самодельно (см. Таблицу материалов). Использовались вирусы Lenti-EGFP (FUCGW) и RCAS-Erbb2 (Neu). Подготовку вируса и определение титра проводили в соответствии с ранее опубликованными отчетами10,12.

1. Подготовка шприца

  1. Обрежьте металлические иглы с металлической ступицей 33 G (см. Таблицу материалов) примерно до 1 см в длину. После автоклавирования храните иглы и шприц объемом 50 мкл в 70% спирте.
  2. Выньте шприцы и иглы из спирта. Вытащите оставшийся спирт из шприца и иглы. Разберите шприц для сушки на воздухе на автоклавной абсорбирующей настольной подушке.
  3. Соберите шприц после высыхания.

2. Подготовка к вирусам

  1. При необходимости достаньте одну или несколько пробирок с вирусным запасом из морозильной камеры с температурой -80 °C и разморозьте вирус на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества клеток, подлежащих заражению, вирус может потребоваться разбавить до предполагаемых титров с использованием 1x PBS в это время.
  2. Добавьте бромфенольный синий, погрузив наконечник пипетки на глубину 1 см в порошок бромфенольного синего (см. Таблицу материалов). Затем добавьте прикрепленное следовое количество бромфенольного синего в вирусную суспензию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования запас вируса обычно составляет 200 мкл на пробирку, поэтому конечная концентрация красителя составляет примерно 0,2% (0,2 мкг / 100 мкл). Бромфенол синий следует стерилизовать микроволновым излучением в течение 45 секунд при высокой мощности 1250 Вт (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что вся процедура проводится в стерильной среде.
  3. Смешайте бромфеноловый синий с раствором вируса, пипеткой вверх и вниз 10 раз.
  4. Поместите вирус на лед и принесите ведро со льдом в виварий.

3. Подготовка животных

  1. Обезболивают самку мыши внутрибрюшинной инъекцией 2 мкл / г анестетика (37,6 мг / мл кетамина, 1,92 мг / мл ксилазина и 0,38 мг / мл ацепромазина, см. Таблицу материалов). Проверьте глубину анестезии с помощью щепотки пальца ноги. Нанесите мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь не должна реагировать на защемление пальцев ног под хорошей анестезией. Изофлуран также может быть использован для анестезии мышей.
  2. Положите мышь в лежачем положении на теплую подушечку и прикрепите все четыре конечности к скамейке с помощью скотча.
  3. Определите один сосок (или несколько) для инъекции (номер 4 является предпочтительным для настоящего исследования). Обнажите его, подстригая окружающие волосы с помощью ножниц.
  4. Нанесите 70% спирт и йодофорные тампоны на область соска в три раунда, чтобы очистить и обнажить сосок.

4. Внутрипротоковая инъекция вируса

ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличительная лампа может быть использована для визуализации отверстия соска.

  1. Разрезайте дистальный конец соска с помощью стерильных пружинных ножниц для микродиссекции, пока под лупой не появится небольшое центральное отверстие протока (см. Таблицу материалов).
  2. Загрузите в шприц 10 мкл смеси вируса и бромфенольного синего.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этой демонстрации используются Lenti-EGFP (FUCGW) и RCAS-Erbb2 (Neu ).
  3. Аккуратно вставьте иглу в отверстие соска с помощью лупы. Ориентация иглы немного корректируется от медиальной к латеральной, чтобы выровнять ее с основным протоком.
  4. Введите все 10 мкл вируса в дерево протоков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протоки под кожей должны посинеть, если инъекция прошла успешно. Любое сопротивление или появление локализованного изменения цвета указывает на неудачу инъекции.
  5. Поместите мышь на подогреватель слайдов, установленный на 45 ° C, пока мышь полностью не проснется (~ 30-60 мин).

5. Обнаружение инфицированных клеток флуоресцентным стереомикроскопом

  1. Через три-пять дней после инъекции вируса, несущего GFP или другие флуоресцентные гены, усыпьте мышь, передозировав ее 4 мкл / г анестетика (37,6 мг / мл кетамина, 1,92 мг / мл ксилазина и 0,38 мг / мл ацепромазина).
  2. Вскрыть грудную полость. Разрежьте кожу вдоль вентральной средней линии, а также вдоль верхних и нижних конечностей с помощью ножниц. Поднимите кожу и обнаживите молочные железы.
  3. Удалите введенную молочную железу с кожи с помощью щипцов и ножниц. Кроме того, удалите неинъецированную железу в качестве контроля.
  4. Поместите молочные железы на предметные стекла и раздвиньте железы до их первоначальной формы.
  5. Наблюдайте и визуализируйте железы под флуоресцентным стереомикроскопом.

Результаты

Здесь представлены репрезентативные данные, демонстрирующие успешную внутрипротоковую инъекцию, успешную вирусную инфекцию и влияние доставленных генов на онкогенез молочной железы. Количество вводимого вируса должно быть адаптировано к цели каждого эксперимента. Чтобы проиллюстр...

Обсуждение

В данной статье демонстрируется методика вирусной внутрипротоковой инъекции для введения генов в эпителиальные клетки молочной железы мыши для моделирования спорадического рака молочной железы. Обычно мышам не менее 5 недель и старше вводят, чтобы онкогенный процесс начался после ра...

Раскрытие информации

Оба автора заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим д-ра Гэри Чамнесса за его полезные комментарии к этой рукописи. Эта работа была поддержана Министерством обороны (DOD) CDMRP BC191649 (YL) и BC191646 (YL), а также Национальными институтами здравоохранения (NIH) CA271498 (YL). Авторы хотели бы поблагодарить Центр патологии молочной железы при поддержке SPORE P50CA186784 и Центр цитометрии и сортировки клеток, поддерживаемый CPRIT-RP180672, NIH CA125123 и RR024574 при содействии Джоэла М. Седерстрома.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-HA antibodyCovanceMMS-101PDilution: 1 : 1000
Artificial TearsCovetrusNDC 11695-0832-1
Bromophenol blueSigmaB5525microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven
FACSCantoIIBD BiosciencesV96100899
Fluorescent stereomicroscopeLeicaMZ16 FA
FUCGW lenti-virusSelf-madeN/ASee reference # 12
FVB/NThe Jackson LaboratoryJAX:001800
Hamilton needleHamilton91033autoclaved
Hamilton syringeHamilton201000autoclaved
LED magnifying lampIntertek3165273
Micro dissection spring scissorRobozRS-5621autoclaved
MMTV-tvaSelf-madeSee reference # 10
RCAS-Neu (HA)Self-madeN/ASee reference # 10
Rodent Comboanesthetic IIIVeterinary PharmacyVeterinary prescription37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine

Ссылки

  1. Nguyen, D. -. A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C., Ip, M. M., Asch, B. B. . Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Eds Margot. , 259-270 (2000).
  2. Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
  3. Costantini, F., Lacy, E. Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line. Nature. 294 (5836), 92-94 (1981).
  4. Brinster, R. L., et al. Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. Cell. 27 (1), 223-231 (1981).
  5. Du, Z., Li, Y. RCAS-TVA in the mammary gland: an in vivo oncogene screen and a high fidelity model for breast transformation. Cell Cycle. 6 (7), 823-826 (2007).
  6. Bu, W., et al. Mammary precancerous stem and non-stem cells evolve into cancers of distinct subtypes. Cancer Research. 79 (1), 61-71 (2019).
  7. Bu, W., et al. Keratin 6a marks mammary bipotential progenitor cells that can give rise to a unique tumor model resembling human normal-like breast cancer. Oncogene. 30 (43), 4399-4409 (2011).
  8. Haricharan, S., et al. Contribution of an alveolar cell of origin to the high-grade malignant phenotype of pregnancy-associated breast cancer. Oncogene. 33 (50), 5729-5739 (2014).
  9. Bu, W., Zhang, X., Dai, H., Huang, S., Li, Y. Mammary cells with active Wnt signaling resist ErbB2-induced tumorigenesis. PLoS One. 8 (11), 78720 (2013).
  10. Du, Z., et al. Introduction of oncogenes into mammary glands in vivo with an avian retroviral vector initiates and promotes carcinogenesis in mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17396-17401 (2006).
  11. Siwko, S. K., et al. Lentivirus-mediated oncogene introduction into mammary cells in vivo induces tumors. Neoplasia. 10 (7), 653-662 (2008).
  12. Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 14 (4), 401-404 (2009).
  13. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).
  14. Wagner, S., Thresher, R., Bland, R., Laible, G. Adeno-associated-virus-mediated transduction of the mammary gland enables sustained production of recombinant proteins in milk. Scientific Reports. 5, 15115 (2015).
  15. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  16. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
  17. Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Current Gene Therapy. 2 (2), 135-144 (2002).
  18. McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
  19. Bu, W., Li, Y. Intraductal injection of lentivirus vectors for stably introducing genes into rat mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 389-396 (2020).
  20. Dong, J., et al. Genetic manipulation of individual somatic mammary cells in vivo reveals a master role of STAT5a in inducing alveolar fate commitment and lactogenesis even in the absence of ovarian hormones. Developmental Biology. 346 (2), 196-203 (2010).
  21. Haricharan, S., et al. Mechanism and preclinical prevention of increased breast cancer risk caused by pregnancy. eLife. 2, 00996 (2013).
  22. Reddy, J. P., et al. Defining the ATM-mediated barrier to tumorigenesis in somatic mammary cells following ErbB2 activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3728-3733 (2010).
  23. Dong, J., et al. The PR status of the originating cell of ER/PR-negative mouse mammary tumors. Oncogene. 35 (31), 4149-4154 (2016).
  24. Young, A., et al. Targeting the pro-survival protein BCL-2 to prevent breast cancer. Cancer Prevention Research. 15 (1), 3-10 (2022).
  25. Schlimgen, R., et al. Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
  26. Holloway, K. R., et al. Krt6a-positive mammary epithelial progenitors are not at increased vulnerability to tumorigenesis initiated by ErbB2. PLoS One. 10 (1), 0117239 (2015).
  27. Holloway, K. R., et al. Targeting oncogenes into a defined subset of mammary cells demonstrates that the initiating oncogenic mutation defines the resulting tumor phenotype. International Journal of Biological Sciences. 12 (4), 381-388 (2016).
  28. Hein, S. M., et al. Luminal epithelial cells within the mammary gland can produce basal cells upon oncogenic stress. Oncogene. 35 (11), 1461-1467 (2015).
  29. Annunziato, S., et al. In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer. EMBO Journal. 39 (5), 102169 (2020).
  30. Annunziato, S., et al. Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes & Development. 30 (12), 1470-1480 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены