Im lebenden Organismus Gentransfer in Brustepithelzellen der Maus durch intraduktale Injektion in der Brust

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die intraduktale Injektion von viralen Vektoren über die Zitze, um Gene von Interesse in die Brustepithelzellen einzuschleusen.

Zusammenfassung

Die Milchdrüsen der Maus bestehen aus duktalen Bäumen, die von Epithelzellen ausgekleidet sind und eine Öffnung an der Spitze jeder Brustwarze haben. Die Epithelzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Funktion der Brustdrüsen und sind der Ursprung der meisten Brusttumoren. Das Einschleusen von Genen von Interesse in Brustepithelzellen von Mäusen ist ein entscheidender Schritt bei der Evaluierung der Genfunktion in Epithelzellen und der Erstellung von Mammatumormodellen der Maus. Dieses Ziel kann durch die intraduktale Injektion eines viralen Vektors, der die interessierenden Gene in den duktalen Brustbaum der Maus trägt, erreicht werden. Das injizierte Virus infiziert anschließend Brustepithelzellen und bringt die interessierenden Gene ein. Der virale Vektor kann lentiviral, retroviral, adenoviral oder Adenovirus-assoziiertes Virus (AAV) sein. Diese Studie zeigt, wie ein interessantes Gen durch intraduktale Injektion eines viralen Vektors in Brustepithelzellen der Brust eingeschleust wird. Ein Lentivirus, das GFP trägt, wird verwendet, um eine stabile Expression eines transportierten Gens zu zeigen, und ein Retrovirus, das Erbb2 (HER2/Neu) trägt, wird verwendet, um onkogeninduzierte atypische hyperplastische Läsionen und Mammatumoren nachzuweisen.

Einleitung

Epithelzellen der Brustdrüsen spielen eine wichtige Rolle bei der Funktion dieser Drüsen und sind die Hauptursprungszelle von Brustkrebs. Studien zur Biologie der Brustdrüse und zur Tumorgenese erfordern häufig den Transport von Genen von Interesse in diese Zellen. Jede Brustdrüse der Maus besteht aus einem von Epithelzellen ausgekleideten Ductusbaum mit einer einzigen Öffnung an der Spitze der Brustwarze. Diese Struktur macht die Brustepithelzellen für virale Vektoren leicht zugänglich, die durch intraduktale Injektion in das Lumen eines duktalen Baumes eingebracht werden können¹.

Die Technik der intraduktalen Injektion der Brust wurde ursprünglich bei viel größeren Tieren wie Ziegen, Kaninchen und Ratten angewendet¹. Bei einem viel kleineren Tier wie Mäusen erfordert die intraduktale Injektion viele empfindliche Werkzeuge und mehr Übungen der Bediener. Es gibt zwei Ansätze für die intraduktale Injektion von Mäusen. Eine davon ist die Zitzeninjektion¹. Eine weitere Möglichkeit ist die direkte Injektion des Primärgangs der Brustdrüse #3 oder #4 nach chirurgischer Exposition¹. Da die erste Technik nicht-invasiv und schneller ist, sobald der Bediener gut geschult ist, wird diese Technik häufiger verwendet und in diesem Artikel ausführlich beschrieben.

Im Vergleich zu den weit verbreiteten traditionellen transgenen Mausmodellen, bei denen das interessierende Gen im Stadium der befruchteten Eizellen durch Mikroinjektion eingeführt wird ^2,3,4, hat die Genübertragung durch die intraduktale Virusinjektionsmethode viele Vorteile^, darunter: (1) es vermeidet den zeitaufwändigen Prozess der Herstellung einer transgenen Mauslinie für jedes Gen von Interesse; (2) es vermeidet eine mögliche Beeinträchtigung der normalen Entwicklung der Brustdrüsen, die durch das interessierende Gen verursacht wird; (3) es führt das interessierende Gen zu einem beliebigen Zeitpunkt nach der Geburt ein; (4) es kann leicht mehr als ein Gen von Interesse einführen; (5) es ahmt den natürlichen tumorigenen Prozess besser nach, da die infizierten und damit Onkogen-tragenden Zellen von normalen Zellen umgeben sind; und (6) in Kombination mit der TVA-Technologie⁽Tumorvirus A, ein aviäres Zelloberflächenprotein und der Rezeptor für den Retrovirus-RCAS-Vektor) 5 das Gen von Interesse in eine bestimmte Zellpopulation eingeführt werden kann, um den Zellursprung der Tumorgenese zu untersuchen und Assays zur Rückverfolgung der Zelllinie in den Brustdrüsen^{durchzuführen 6,7,8, 9}. Sonstiges

Alle Vektoren, die von Retrovirus 10, Lentivirus 11,12, Adenovirus 13 und Adenovirus-assoziiertem Virus (AAV)¹⁴ abgeleitet sind^, können für die intraduktale Verabreichung von genetischem Material verwendet werden. Retrovirus- und Lentivirus-Vektoren integrieren sich dauerhaft in das Wirtsgenom; Auf diese Weise schleusen sie interessante Gene stabil in Brustepithelzellen ein. Während sich das Lentivirus in das Genom jeder Zelle integrieren kann, auf die es trifft¹⁵, erfordert die effiziente genomische Integration des Retrovirus die Proliferation der Zielzellen¹⁶. Die adenoviralen und AAV-Vektoren integrieren sich nicht in das Genom infizierter Zellen und exprimieren daher nur vorübergehend das interessierende Gen^17,18. Diese Eigenschaft kann von Vorteil sein, wenn das interessierende Gen nur für kurze Zeit exprimiert werden muss, wie z. B. Cre, um ein gefloxtes Tumorsuppressorgen zu löschen.

Lentivirus, Adenovirus und AAV infizieren alle Mäusezellen, denen sie begegnen. Da das luminale Epithel jedoch weitgehend von der darunter liegenden Basalschicht isoliert ist, die durch die Basalmembran weiter vom Stroma getrennt ist, beschränkt die intraduktale Injektion die Infektion weitgehend auf luminale Epithelzellen, die primäre Ursprungszelle von Brustkrebs. Innerhalb dieser luminalen Epithelschicht gibt es auch verschiedene Zellsubtypen, darunter Stammzellen, Vorläuferzellen und mehrere Gruppen differenzierter Zellen. Um bestimmte Zelluntergruppen innerhalb der luminalen Zellpopulation zu infizieren, kann die TVA-Technologie verwendet werden, mit der von aviären Leukoseviren abgeleitete RCAS-Vektoren^5,10 oder pseudotypisierte lentivirale Vektoren¹¹ selektiv die Zellen infizieren, die TVA in Mäusen exprimieren, die ein tva-Transgen unter der Kontrolle eines zelltypspezifischen Promotors tragen, wie z. B. eines Promotors^, der nur in Stammzellen 6 oder bestimmter Vorläuferzellen⁶ aktiv ist^{, 7} oder Alveolarzellen⁸ oder Wnt-Signalweg-aktive Zellen⁹.

Dieses Protokoll stellt die Technik vor, bei der Gene von Interesse durch intraduktale Injektion eines viralen Vektors in Brustepithelzellen eingeführt werden. Anschließend wird die Detektion der Expression der eingeführten Gene und die daraus resultierenden hyperplastischen Läsionen und Tumoren demonstriert.

Protokoll

Alle Eingriffe mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Tierprotokoll durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden 9-12 Wochen alte weibliche FVB/N- oder MMTV-tva-Mäuse verwendet. Die Mäuse wurden kommerziell oder selbst hergestellt (siehe Materialtabelle). Zum Einsatz kamen die Viren Lenti-EGFP (FUCGW) und RCAS-Erbb2 (Neu). Die Viruspräparation und die Titerbestimmung erfolgten in Anlehnung an die zuvor veröffentlichten Berichte^10,12.

1. Vorbereitung der Spritze

1. Die 33 g langen Nadeln aus Metall (siehe Materialtabelle) auf ca. 1 cm Länge zuschneiden. Bewahren Sie die Nadeln und die 50-μl-Spritze nach dem Autoklavieren in 70%igem Alkohol auf.
2. Nehmen Sie Spritzen und Nadeln aus dem Alkohol. Drücke den restlichen Alkohol aus der Spritze und der Nadel. Zerlegen Sie die Spritze zum Trocknen an der Luft auf einer autoklavierten, saugfähigen Bankunterlage.
3. Setzen Sie die Spritze nach dem Trocknen zusammen.

2. Vorbereitung des Virus

1. Nehmen Sie je nach Bedarf ein oder mehrere Virusröhrchen aus dem -80 °C Gefrierschrank und tauen Sie das Virus auf Eis auf.
   HINWEIS: Abhängig von der Anzahl der zu infizierenden Zellen muss das Virus möglicherweise mit 1x PBS zu diesem Zeitpunkt mit 1x PBS in die vorgesehenen Titer verdünnt werden.
2. Fügen Sie Bromphenolblau hinzu, indem Sie die Pipettenspitze bis zu einer Tiefe von 1 cm in das Bromphenolblaupulver tauchen (siehe Materialtabelle). Bringen Sie dann die angehängte Spurenmenge Bromphenolblau in die Virussuspension.
   HINWEIS: Für die vorliegende Studie beträgt der Virusbestand normalerweise 200 μl pro Röhrchen, so dass die endgültige Farbstoffkonzentration etwa 0,2 % (0,2 μg/100 μl) beträgt. Bromphenolblau sollte 45 Sekunden lang mit Mikrowellenstrahlung bei hoher Leistung von 1250 W sterilisiert werden (siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass Sie das gesamte Verfahren in einer sterilen Umgebung durchführen.
3. Mischen Sie das Bromphenolblau mit der Viruslösung, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren.
4. Legen Sie das Virus auf Eis und bringen Sie den Eiskübel zum Vivarium.

3. Vorbereitung der Tiere

1. Betäubung einer weiblichen Maus durch intraperitoneale Injektion von 2 μl/g Anästhetikum (37,6 mg/ml Ketamin, 1,92 mg/ml Xylazin und 0,38 mg/ml Acepromazin, siehe Materialtabelle). Überprüfen Sie die Narkosetiefe mit einer Zehenzwicke. Tragen Sie Salbe auf die Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu vermeiden.
   HINWEIS: Die Maus muss unter guter Betäubung nicht auf Zehenkneifen reagieren. Isofluran kann auch zur Betäubung der Mäuse verwendet werden.
2. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine warme Unterlage und befestigen Sie alle vier Gliedmaßen mit Klebeband an der Bank.
3. Identifizieren Sie eine Brustwarze (oder mehrere), die injiziert werden soll (Nummer 4 wird für die vorliegende Studie bevorzugt). Legen Sie es frei, indem Sie das umgebende Haar mit einer Schere abschneiden.
4. Tragen Sie 70%igen Alkohol und Jodophor-Tupfer in drei Runden auf den Brustwarzenbereich auf, um die Brustwarze zu reinigen und freizulegen.

4. Intraduktale Injektion des Virus

Anmerkungen: Eine Lupenlampe kann verwendet werden, um die Nippelöffnung zu visualisieren.

1. Die distale Spitze einer Brustwarze wird mit einer sterilen Mikrodissektions-Federschere durchtrennt, bis unter einer Lupenlampe eine kleine zentrale Kanalöffnung zu sehen ist (siehe Materialtabelle).
2. Geben Sie 10 μl Virus/Bromphenolblau-Gemisch in die Spritze.
   HINWEIS: In dieser Demonstration werden Lenti-EGFP (FUCGW) und RCAS-Erbb2 (Neu) verwendet.
3. Führen Sie die Nadel vorsichtig mit Hilfe der Lupenlampe in die Nippelöffnung ein. Die Ausrichtung der Nadel wird leicht von medial nach lateral angepasst, um sie mit dem Hauptkanal auszurichten.
4. Injizieren Sie die gesamten 10 μl des Virus in den Duct Tree.
   HINWEIS: Die Kanäle unter der Haut sollten sich blau färben, wenn die Injektion erfolgreich war. Jeder Widerstand oder das Auftreten einer lokalisierten Farbänderung weist auf ein Versagen der Injektion hin.
5. Stellen Sie die Maus auf einen Diawärmer, der auf 45 °C eingestellt ist, bis die Maus vollständig aufgewacht ist (~30-60 min).

5. Detektion infizierter Zellen durch ein fluoreszierendes Stereomikroskop

1. Drei bis fünf Tage nach der Injektion des Virus, das GFP oder andere fluoreszierende Gene trägt, wird die Maus durch Überdosierung mit 4 μl/g Anästhetikum (37,6 mg/ml Ketamin, 1,92 mg/ml Xylazin und 0,38 mg/ml Acepromazin) eingeschläfert.
2. Öffne die Brusthöhle. Schneiden Sie die Haut mit einer Schere entlang der ventralen Mittellinie und entlang der oberen und unteren Gliedmaßen. Heben Sie die Haut an und legen Sie die Brustdrüsen frei.
3. Entfernen Sie die injizierte Brustdrüse mit einer Pinzette und einer Schere aus der Haut. Entfernen Sie auch eine nicht injizierte Drüse als Kontrolle.
4. Legen Sie die Brustdrüsen auf Glasobjektträger und spreizen Sie die Drüsen in ihre ursprüngliche Form.
5. Beobachte und bilde die Drüsen unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop ab.

Ergebnisse

Repräsentative Daten werden hier präsentiert, um die erfolgreiche intraduktale Injektion, die erfolgreiche Virusinfektion und den Einfluss der gelieferten Gene auf die Entstehung von Mammatumoren zu demonstrieren. Die Menge des injizierten Virus muss auf den Zweck des jeweiligen Experiments abgestimmt sein. Um zu veranschaulichen, wie umfangreich der Milchgangbaum infiziert sein kann, muss eine große Menge an abgebildeten Virus-tragenden Genen wie GFP verwendet werden. Um die natürliche spontane Tumorgenese nachzuahm...

Diskussion

Dieser Artikel demonstriert die virale intraduktale Injektionstechnik zur Einschleusung von Genen in Brustepithelzellen von Mäusen zur Modellierung von sporadischem Brustkrebs. In der Regel werden Mäuse, die mindestens 5 Wochen oder älter sind, injiziert, damit der onkogene Prozess beginnt, nachdem sich die Brustdrüse entwickelt hat. Außerdem ist die Brustwarzenöffnung von Mäusen, die jünger als 5 Wochen sind, oft zu klein für eine Injektion. Auf der anderen Seite sind die Brustwarzen von sehr alten Mäusen manc...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-HA antibody	Covance	MMS-101P	Dilution: 1 : 1000
Artificial Tears	Covetrus	NDC 11695-0832-1
Bromophenol blue	Sigma	B5525	microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven
FACSCantoII	BD Biosciences	V96100899
Fluorescent stereomicroscope	Leica	MZ16 FA
FUCGW lenti-virus	Self-made	N/A	See reference # 12
FVB/N	The Jackson Laboratory	JAX:001800
Hamilton needle	Hamilton	91033	autoclaved
Hamilton syringe	Hamilton	201000	autoclaved
LED magnifying lamp	Intertek	3165273
Micro dissection spring scissor	Roboz	RS-5621	autoclaved
MMTV-tva	Self-made		See reference # 10
RCAS-Neu (HA)	Self-made	N/A	See reference # 10
Rodent Comboanesthetic III	Veterinary Pharmacy	Veterinary prescription	37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine