In vivo Entrega de Genes em Células Epiteliais Mamárias de Camundongos Através de Injeção Intraductal Mamária

Resumo

O presente protocolo descreve a injeção intraductal de vetores virais via teto para entregar genes de interesse nas células epiteliais mamárias.

Resumo

As glândulas mamárias de camundongos compreendem árvores ductais, que são revestidas por células epiteliais e têm uma abertura na ponta de cada mamilo. As células epiteliais desempenham um papel importante na função da glândula mamária e são a origem da maioria dos tumores mamários. A introdução de genes de interesse em células epiteliais mamárias de camundongos é um passo crítico na avaliação da função gênica em células epiteliais e na geração de modelos de tumores mamários de camundongos. Este objetivo pode ser alcançado através da injeção intraductal de um vetor viral carreando os genes de interesse na árvore ductal mamária de camundongos. Posteriormente, o vírus injetado infecta células epiteliais mamárias, trazendo os genes de interesse. O vetor viral pode ser lentiviral, retroviral, adenoviral ou viral associado a adenovírus (AAV). Este estudo demonstra como um gene de interesse é entregue em células epiteliais mamárias através da injeção intraductal mamária de um vetor viral em camundongos. Um lentivírus carreando GFP é usado para mostrar a expressão estável de um gene liberado, e um retrovírus carreando Erbb2 (HER2/Neu) é usado para demonstrar lesões hiperplásicas atípicas induzidas por oncogenes e tumores mamários.

Introdução

As células epiteliais das glândulas mamárias desempenham um papel importante na função dessas glândulas e são a principal célula de origem do câncer de mama. Estudos da biologia da glândula mamária e tumorigênese frequentemente necessitam da entrega de gene(s) de interesse nessas células. Cada glândula mamária de camundongo compreende uma árvore ductal revestida por células epiteliais com uma única abertura na ponta do mamilo. Essa estrutura torna as células epiteliais mamárias facilmente acessíveis aos vetores virais, que podem ser liberados para a luz de uma árvore ductal por injeção intraductal¹.

A técnica de injeção intraductal mamária foi originalmente utilizada para animais muito maiores, como cabras, coelhos e ratos¹. Para um animal muito menor, como camundongos, a injeção intraductal precisa de muitas ferramentas delicadas e mais práticas dos operadores. Existem duas abordagens para injeção intraductal em camundongos. Uma delas é a injeção de teto¹. Outra é a injeção direta do ducto primário da glândula mamária #3 ou #4 após exposição cirúrgica¹. Como a primeira é não invasiva e mais rápida uma vez que o operador tenha sido bem treinado, essa técnica é mais comumente usada e será descrita em detalhes neste artigo.

Em comparação com os modelos tradicionais de camundongos transgênicos amplamente utilizados, nos quais o gene de interesse é introduzido na fase de ovos fertilizados por microinjeção ^2,3,4, a liberação gênica pelo método de injeção intraductal de vírus apresenta muitas vantagens, incluindo: (1) evita o demorado processo de confecção de uma linhagem de camundongo transgênico para cada gene de interesse; (2) evita possíveis prejuízos no desenvolvimento normal das glândulas mamárias impostos pelo gene de interesse; (3) introduz o gene de interesse em qualquer momento desejado após o nascimento; (4) pode facilmente co-introduzir mais de um gene de interesse; (5) mimetiza melhor o processo tumorigênico natural, pois as células infectadas e, portanto, portadoras de oncogenes são circundadas por células normais; e (6) em combinação com a tecnologia TVA (tumor virus A, uma proteína de superfície celular aviária e receptor para vetor RCAS de retrovírus)⁵, o gene de interesse pode ser introduzido em uma população celular específica para estudar a origem celular da tumorigênese e conduzir ensaios de rastreamento de linhagem celular nas glândulas mamárias ^{6,7,8, 9º}.

Quaisquer vetores derivados de retrovírus¹⁰, lentivírus 11,12^, adenovírus¹³ e vírus associado a adenovírus (AAV)¹⁴ podem ser usados para liberação intraductal de materiais genéticos. Vetores de retrovírus e lentivírus integram-se ao genoma do hospedeiro permanentemente; assim, introduzem genes de interesse de forma estável nas células epiteliais mamárias. Enquanto o lentivírus pode se integrar ao genoma de qualquer célula que encontre¹⁵, a integração genômica eficiente do retrovírus necessita da proliferação das células-alvo¹⁶. Os vetores adenoviral e AAV não se integram ao genoma das células infectadas e, portanto, expressam apenas transitoriamente o gene de interesse^17,18. Essa característica pode ser uma vantagem quando o gene de interesse precisa ser expresso por apenas um curto período de tempo, como Cre, para excluir um gene supressor de tumor floxed.

Lentivírus, adenovírus e AAV infectam quaisquer células de camundongo que encontrarem. Mas como o epitélio luminal é amplamente isolado da camada basal subjacente, que é separada do estroma pela membrana basal, a injeção intraductal limita a infecção em grande parte às células epiteliais luminais, a célula primária de origem do câncer de mama. Dentro dessa camada epitelial luminal, existem também subtipos celulares distintos, incluindo células-tronco, células progenitoras e vários grupos de células diferenciadas. Para infectar subgrupos celulares específicos dentro da população de células luminais, pode ser usada a tecnologia TVA, com a qual vetores RCAS derivados do vírus da leucose aviária^5,10 ou vetores lentivirais pseudotipados¹¹ infectam seletivamente as células que expressam TVA em camundongos portadores de um transgene tva sob o controle de um promotor específico do tipo celular, como um promotor ativo apenas em células-tronco 6 ou certos progenitores ^{6, 7} ou células alveolares⁸ ou células ativas da via Wnt⁹.

Este protocolo apresenta a técnica de introdução de genes de interesse em células epiteliais mamárias através da injeção intraductal de um vetor viral. A detecção da expressão dos genes introduzidos e as lesões e tumores hiperplásicos resultantes são então demonstrados.

Protocolo

Todos os procedimentos com camundongos foram realizados de acordo com o protocolo de animais aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. Para o presente estudo, camundongos fêmeas com 9-12 semanas de idade FVB/N ou MMTV-tva foram usados. Os camundongos foram obtidos comercialmente ou de fabricação própria (ver Tabela de Materiais). Foram utilizados os vírus Lenti-EGFP (FUCGW) e RCAS-Erbb2 (Neu). A preparação e a determinação dos títulos virais foram realizadas seguindo os relatos previamente publicados^10,12.

1. Preparação da seringa

1. Corte as agulhas do cubo de metal de 33 G (ver Tabela de Materiais) com aproximadamente 1 cm de comprimento. Armazenar as agulhas e a seringa de 50 μL em álcool a 70% após a autoclavagem.
2. Retire seringas e agulhas do álcool. Empurre o álcool restante para fora da seringa e da agulha. Desmonte a seringa para secagem ao ar em uma bancada absorvente autoclavada.
3. Monte a seringa após a secagem.

2. Preparação do vírus

1. Retire um ou vários tubos de estoque viral, conforme necessário, do freezer de -80 °C e descongele o vírus no gelo.
   NOTA: Dependendo do número de células a serem infectadas, o vírus pode precisar ser diluído em títulos pretendidos usando 1x PBS neste momento.
2. Adicione azul de bromofenol mergulhando a ponta da pipeta a uma profundidade de 1 cm no pó azul de bromofenol (ver Tabela de Materiais). Em seguida, traga a quantidade de vestígio anexado de azul de bromofenol para a suspensão do vírus.
   NOTA: Para o presente estudo, o estoque viral é geralmente de 200 μL por tubo, de modo que a concentração final do corante é de aproximadamente 0,2% (0,2 μg/100 μL). O azul de bromofenol deve ser esterilizado com radiação de micro-ondas por 45 segundos a uma potência de 1250 W (ver Tabela de Materiais). Certifique-se de realizar todo o procedimento em um ambiente estéril.
3. Misture o azul de bromofenol com a solução de vírus pipetando para cima e para baixo 10 vezes.
4. Coloque o vírus no gelo e leve o balde de gelo para o biotério.

3. Preparo dos animais

1. Anestesiar uma fêmea de camundongo por injeção intraperitoneal de 2 μL/g de anestésico (37,6 mg/mL de cetamina, 1,92 mg/mL de xilazina e 0,38 mg/mL de acepromazina, ver Tabela de Materiais). Verifique a profundidade da anestesia com uma pinça no dedo do pé. Aplique pomada nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
   NOTA: O rato não deve responder à pinça dos dedos dos pés sob boa anestesia. O isoflurano também pode ser usado para anestesiar os camundongos.
2. Coloque o mouse em decúbito dorsal em uma almofada quente e prenda os quatro membros ao banco usando fita adesiva.
3. Identificar um mamilo (ou mais) a ser injetado (o número 4 é preferido para o presente estudo). Exponha aparando o cabelo ao redor usando uma tesoura.
4. Aplique álcool 70% e cotonetes iodóforos na área do mamilo em três rodadas para limpar e expor o mamilo.

4. Injeção intraductal de vírus

NOTA: Uma lâmpada de aumento pode ser usada para ajudar a visualizar a abertura do mamilo.

1. Transeccionar a ponta distal de um mamilo usando um par de tesouras estéreis de mola de microdissecação, até que uma pequena abertura ductal central possa ser vista sob uma lâmpada de aumento (ver Tabela de Materiais).
2. Coloque 10 μL da mistura vírus/azul de bromofenol na seringa.
   NOTA: Lenti-EGFP (FUCGW) e RCAS-Erbb2 (Neu) são usados nesta demonstração.
3. Introduza cuidadosamente a agulha na abertura do mamilo com a ajuda da lâmpada de lupa. A orientação da agulha é ligeiramente ajustada de medial para lateral para alinhar com o ducto principal.
4. Injete todos os 10 μL do vírus na árvore do duto.
   NOTA: Os ductos sob a pele devem ficar azuis, se a injeção for bem-sucedida. Qualquer resistência ou o aparecimento de uma mudança de cor localizada indica a falha da injeção.
5. Coloque o mouse em um aquecedor de slides definido a 45 °C até que o mouse acorde completamente (~30-60 min).

5. Detecção de células infectadas por estereomicroscópio fluorescente

1. Três a cinco dias após a injeção do vírus portador de GFP ou outros genes fluorescentes, eutanasiar o camundongo com sobredosagem com 4 uL/g de anestésico (37,6 mg/mL de cetamina, 1,92 mg/mL de xilazina e 0,38 mg/mL de acepromazina).
2. Abra a cavidade torácica. Cortar a pele ao longo da linha média ventral e ao longo dos membros superiores e inferiores usando uma tesoura. Levante a pele e exponha as glândulas mamárias.
3. Remova a glândula mamária injetada da pele usando um par de pinças e tesouras. Além disso, remova uma glândula não injetada como controle.
4. Coloque as glândulas mamárias em lâminas de vidro e espalhe as glândulas para sua forma original.
5. Observe e visualize as glândulas sob um estereomicroscópio fluorescente.

Resultados

Dados representativos são apresentados aqui para demonstrar o sucesso da injeção intraductal, a infecção viral bem-sucedida e o impacto dos genes liberados na tumorigênese mamária. A quantidade de vírus injetada deve ser adaptada ao objetivo de cada experimento. Para ilustrar o quão extensivamente a árvore do ducto mamário pode ser infectada, uma grande quantidade de genes portadores de vírus que podem ser imageados, como GFP, precisa ser usada. Por outro lado, para mimetizar a tumorigênese espontânea natur...

Discussão

Este artigo demonstra a técnica de injeção intraductal viral para introdução de genes em células epiteliais mamárias de camundongos para modelagem de câncer de mama esporádico. Normalmente, camundongos de pelo menos 5 semanas ou mais são injetados para que o processo oncogênico comece depois que a glândula mamária é desenvolvida. Além disso, a abertura do mamilo de camundongos com menos de 5 semanas de idade é muitas vezes muito pequena para injeção. Por outro lado, os mamilos de camundongos muito velho...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-HA antibody	Covance	MMS-101P	Dilution: 1 : 1000
Artificial Tears	Covetrus	NDC 11695-0832-1
Bromophenol blue	Sigma	B5525	microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven
FACSCantoII	BD Biosciences	V96100899
Fluorescent stereomicroscope	Leica	MZ16 FA
FUCGW lenti-virus	Self-made	N/A	See reference # 12
FVB/N	The Jackson Laboratory	JAX:001800
Hamilton needle	Hamilton	91033	autoclaved
Hamilton syringe	Hamilton	201000	autoclaved
LED magnifying lamp	Intertek	3165273
Micro dissection spring scissor	Roboz	RS-5621	autoclaved
MMTV-tva	Self-made		See reference # 10
RCAS-Neu (HA)	Self-made	N/A	See reference # 10
Rodent Comboanesthetic III	Veterinary Pharmacy	Veterinary prescription	37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine