インビボ 乳腺内注射によるマウス乳腺上皮細胞への遺伝子導入

要約

本プロトコルは、乳頭 を介した ウイルスベクターの乳管内注射を記載し、目的の遺伝子を乳腺上皮細胞に送達する。

要約

マウス乳腺は、上皮細胞が並ぶ管樹で構成され、各乳首の先端に1つの開口部があります。上皮細胞は乳腺機能に大きな役割を果たしており、ほとんどの乳腺腫瘍の起源です。目的の遺伝子をマウス乳腺上皮細胞に導入することは、上皮細胞における遺伝子機能を評価し、マウス乳腺腫瘍モデルを作成する上で重要なステップです。この目標は、目的の遺伝子を運ぶウイルスベクターをマウス乳管樹に管内注射することによって達成できます。注入されたウイルスはその後乳腺上皮細胞に感染し、目的の遺伝子を持ち込みます。ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノウイルス関連ウイルス(AAV)であり得る。この研究は、ウイルスベクターのマウス乳管内注射を通じて、目的の遺伝子が乳腺上皮細胞にどのように送達されるかを示しています。 GFP を保有するレンチウイルスは送達された遺伝子の安定した発現を示すために使用され、 Erbb2 (HER2 / Neu)を運ぶレトロウイルスは癌遺伝子誘発性の非定型過形成病変および乳腺腫瘍を示すために使用されます。

概要

乳腺の上皮細胞は、これらの腺の機能に大きな役割を果たしており、乳がんの起源の主要な細胞です。乳腺生物学および腫瘍形成の研究は、しばしばこれらの細胞への目的の遺伝子の送達を必要とする。各マウス乳腺は、乳頭の先端に単一の開口部を有する上皮細胞によって裏打ちされた管樹を含む。この構造により、乳腺上皮細胞はウイルスベクターに容易にアクセスでき、乳管内注射 を介して 乳管樹の内腔に送達することができます¹。

乳管内注射の技術は、もともとヤギ、ウサギ、ラットなどのはるかに大きな動物に使用されていました¹。マウスのようなはるかに小さな動物の場合、管内注射には多くの繊細なツールとオペレーターのより多くの練習が必要です。マウスの乳管内注射には2つのアプローチがあります。1つは乳首注射¹です。もう1つは、外科的曝露後の#3または#4乳腺の一次管の直接注射^です1。最初の手法は非侵襲的で、オペレーターが十分に訓練されると高速であるため、この手法がより一般的に使用され、この記事で詳しく説明します。

目的の遺伝子が^{マイクロインジェ}クション^2,3,4によって受精卵の段階で導入される広く使用されている従来のトランスジェニックマウスモデルと比較して、管内ウイルス注入法による遺伝子送達には、以下を含む多くの利点があります。(2)目的の遺伝子によって課せられる乳腺の正常な発達に対する潜在的な障害を回避します。(3)出生後任意の時期に目的の遺伝子を導入する;(4)目的の遺伝子を2つ以上容易に同時導入できる;(5)感染した癌遺伝子を運ぶ細胞は正常細胞に囲まれているため、自然の腫瘍形成プロセスをよりよく模倣します。(6)TVA(腫瘍ウイルスA、鳥類細胞表面タンパク質およびレトロウイルスRCASベクターの受容体)技術⁵と組み合わせて、目的の遺伝子を特定の細胞集団に導入して、腫瘍形成の細胞起源を研究し、乳腺における細胞系譜追跡アッセイを実施することができる⁶、⁷、^8、9.

レトロウイルス10、レンチウイルス11、12、アデノウイルス13^、およびアデノウイルス関連ウイルス(AAV)¹⁴に由来する任意のベクターを、遺伝物質の管内送達に使用できます。レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターは、宿主ゲノムに永久に組み込まれます。これにより、目的の遺伝子を乳腺上皮細胞に安定して導入します。レンチウイルスは遭遇する任意の細胞のゲノムに組み込むことができるが¹⁵、レトロウイルスの効率的なゲノム統合には標的細胞の増殖が必要である¹⁶。アデノウイルスおよびAAVベクターは感染細胞のゲノムに組み込まれないため、目的の遺伝子を一時的に発現するだけです^17,18。この特徴は、フロックス腫瘍抑制遺伝子を欠失させるために、Creなどの目的の遺伝子を短時間だけ発現させる必要がある場合に有利となり得る。

レンチウイルス、アデノウイルス、およびAAVは、遭遇するマウス細胞に感染します。しかし、管腔上皮は基底膜によって間質からさらに分離されている下にある基底層から大部分が絶縁されているため、管内注射は感染を主に乳がんの起源の初代細胞である管腔上皮細胞に限定します。この管腔上皮層内には、幹細胞、前駆細胞、および分化細胞のいくつかのグループを含む、異なる細胞サブタイプもあります。管腔細胞集団内の特定の細胞サブセットに感染するために、TVA技術が使用され得、これを用いて、トリ白血病ウイルス由来RCAS^{ベクター5}、¹⁰または偽型レンチウイルス^{ベクター11}が、幹細胞⁶または特定の前駆細胞6においてのみ活性であるプロモーターなどの細胞型特異的プロモーターの制御下でTVA導入遺伝子を有するマウスにおいてTVAを発現する細胞に選択的に感染する^、7または肺胞細胞⁸またはWnt経路活性細胞⁹。

このプロトコルは、ウイルスベクターの管内注射を通じて乳腺上皮細胞に目的の遺伝子を導入する技術を提示します。次に、導入された遺伝子の発現および結果として生じる過形成病変および腫瘍の検出が実証される。

プロトコル

マウスを用いた全ての手順は、施設動物管理使用委員会が承認した動物プロトコルに準拠して実施した。本研究では、9〜12週齢のFVB / NまたはMMTV-tva 雌マウスを使用しました。マウスは、商業的または自作的に入手した( 材料表参照)。Lenti-EGFP (FUCGW)およびRCAS-Erbb2(Neu) ウイルスを使用した。ウイルス調製および力価決定は、以前に公表された報告^10、12に従って行った。

1.シリンジの準備

1. 33Gの金属製ハブニードル( 材料の表を参照)を長さ約1cmにカットします。オートクレーブ処理後、針と50 μLシリンジを70%アルコールで保管します。
2. アルコールから注射器と針を取り出します。残りのアルコールを注射器と針から押し出します。オートクレーブ滅菌された吸収性ベンチパッド上で空気乾燥するためにシリンジを分解します。
3. 乾燥後にシリンジを組み立てます。

2.ウイルスの準備

1. 必要に応じて1つまたは複数のウイルスストックチューブを-80°Cの冷凍庫から取り出し、氷上でウイルスを解凍します。
   注:感染する細胞の数によっては、この時点で1x PBSを使用してウイルスを目的の力価に希釈する必要がある場合があります。
2. ピペットチップをブロモフェノールブルー粉末に1cmの深さまで浸して、ブロモフェノールブルーを追加します( 材料の表を参照)。次に、付着した微量のブロモフェノールブルーをウイルス懸濁液に入れます。
   注:本研究では、ウイルスストックは通常チューブあたり200 μLであるため、最終的な色素濃度は約0.2%(0.2 μg / 100 μL)です。ブロモフェノールブルーは、1250 Wの高出力で45秒間マイクロ波放射で滅菌する必要があります(材料の表を参照)。手順全体を無菌環境で運ぶようにしてください。
3. ブロモフェノールブルーを10回上下にピペッティングしてウイルス溶液と混合します。
4. ウイルスを氷の上に置き、氷のバケツをビバリウムに持って行きます。

3.動物の準備

1. 2 μL / gの麻酔薬(37.6 mg / mLケタミン、1.92 mg / mLキシラジン、および0.38 mg / mLアセプロマジン、 材料の表を参照)の腹腔内注射により、雌マウスを麻酔します。.つま先のつまみで麻酔の深さを確認します。麻酔下での乾燥を防ぐために目に軟膏を塗ります。
   注意: マウスは、十分な麻酔下でつま先のつまみに反応しない必要があります。イソフルランはまた、マウスを麻酔するために使用され得る。
2. マウスを暖かいパッドの上に仰臥位にし、粘着テープを使用して四肢すべてをベンチに取り付けます。
3. 注射する乳首を1つ(または複数)特定します(本研究では4番が好ましい)。ハサミを使って周囲の髪をトリミングして露出させます。
4. 70%アルコールとヨードフォア綿棒を乳首領域に3ラウンドで塗布し、乳首をきれいにして露出させます。

4.ウイルスの管内注射

注意: 拡大lamp 乳首の開口部を視覚化するために使用できます。

1. 拡大鏡ランプの下に小さな中央管開口部が見えるまで、滅菌マイクロダイセクションスプリングはさみを使用して乳首の遠位先端を横断します( 材料の表を参照)。
2. 10 μLのウイルス/ブロモフェノールブルー混合物をシリンジに入れます。
   注:このデモンストレーションでは、Lenti-EGFP (FUCGW)とRCAS-Erbb2(Neu) を使用しています。
3. 拡大鏡ランプを使用して、針を乳首の開口部に慎重に挿入します。針の向きは、主管に合わせて内側から外側にわずかに調整されます。
4. 10 μLのウイルス全体をダクトツリーに注入します。
   注:注射が成功すると、皮膚の下のダクトが青くなるはずです。局所的な色の変化の抵抗または外観は、注射の失敗を示します。
5. マウスが完全にウェイクアップするまで(~30-60分)、45°Cに設定されたスライドウォーマーにマウスを置きます。

5. 蛍光実体顕微鏡による感染細胞の検出

1. GFPまたは他の蛍光遺伝子を搭載したウイルスを注射してから3〜5日後、4 uL / gの麻酔薬(37.6 mg / mLケタミン、1.92 mg / mLキシラジン、および0.38 mg / mLアセプロマジン)を過剰投与してマウスを安楽死させます。
2. 胸腔を開きます。はさみを使用して、腹側の中央線に沿って、および上肢と下肢に沿って皮膚を切ります。皮膚を持ち上げて乳腺を露出させます。
3. 鉗子とはさみを使用して、注射した乳腺を皮膚から取り除きます。また、コントロールとして注射されていない腺を取り除きます。
4. 乳腺をスライドガラスの上に置き、腺を元の形に広げます。
5. 蛍光実体顕微鏡で腺を観察し、画像化します。

結果

代表的なデータは、管内注射の成功、ウイルス感染の成功、および乳腺腫瘍形成に対する送達された遺伝子の影響を示すためにここに提示されています。注入されるウイルスの量は、各実験の目的に合わせて調整する必要があります。乳管樹がどれほど広範囲に感染するかを説明するには、GFPなどの画像化可能な遺伝子を運ぶ大量のウイルスを使用する必要があります。一方、自然な自発的?...

ディスカッション

本稿では、マウス乳腺上皮細胞に遺伝子を導入するためのウイルス管内注射技術を示し、散発性乳癌をモデル化する。通常、少なくとも5週以上のマウスは、乳腺が発達した後に発癌過程が始まるように注射される。その上、5週齢未満のマウスの乳頭開口部は、注射するには小さすぎることがよくあります。一方、非常に古いマウスの乳首は時々退化しており、切断では管開口部が明らかに?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-HA antibody	Covance	MMS-101P	Dilution: 1 : 1000
Artificial Tears	Covetrus	NDC 11695-0832-1
Bromophenol blue	Sigma	B5525	microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven
FACSCantoII	BD Biosciences	V96100899
Fluorescent stereomicroscope	Leica	MZ16 FA
FUCGW lenti-virus	Self-made	N/A	See reference # 12
FVB/N	The Jackson Laboratory	JAX:001800
Hamilton needle	Hamilton	91033	autoclaved
Hamilton syringe	Hamilton	201000	autoclaved
LED magnifying lamp	Intertek	3165273
Micro dissection spring scissor	Roboz	RS-5621	autoclaved
MMTV-tva	Self-made		See reference # 10
RCAS-Neu (HA)	Self-made	N/A	See reference # 10
Rodent Comboanesthetic III	Veterinary Pharmacy	Veterinary prescription	37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine