In vivo Livraison de gènes dans des cellules épithéliales mammaires de souris par injection intracanalaire mammaire

Résumé

Le présent protocole décrit l’injection intracanalaire de vecteurs viraux via la tétine pour délivrer des gènes d’intérêt dans les cellules épithéliales mammaires.

Résumé

Les glandes mammaires de souris comprennent des arbres canalaires, qui sont tapissés de cellules épithéliales et ont une ouverture à l’extrémité de chaque mamelon. Les cellules épithéliales jouent un rôle majeur dans la fonction de la glande mammaire et sont à l’origine de la plupart des tumeurs mammaires. L’introduction de gènes d’intérêt dans les cellules épithéliales mammaires de souris est une étape critique dans l’évaluation de la fonction des gènes dans les cellules épithéliales et la génération de modèles de tumeurs mammaires de souris. Cet objectif peut être atteint par l’injection intracanalaire d’un vecteur viral transportant les gènes d’intérêt dans l’arbre canalaire mammaire de la souris. Le virus injecté infecte ensuite les cellules épithéliales mammaires, apportant les gènes d’intérêt. Le vecteur viral peut être lentiviral, rétroviral, adénoviral, ou viral associé à l’adénovirus (AAV). Cette étude démontre comment un gène d’intérêt est délivré dans les cellules épithéliales mammaires par injection intracanalaire mammaire de souris d’un vecteur viral. Un lentivirus porteur de la GFP est utilisé pour montrer l’expression stable d’un gène délivré, et un rétrovirus porteur d’Erbb2 (HER2 / Neu) est utilisé pour mettre en évidence des lésions hyperplasiques atypiques induites par l’oncogène et des tumeurs mammaires.

Introduction

Les cellules épithéliales des glandes mammaires jouent un rôle majeur dans la fonction de ces glandes et sont la principale cellule d’origine du cancer du sein. Les études sur la biologie de la glande mammaire et la tumorigenèse nécessitent souvent la livraison de gènes d’intérêt dans ces cellules. Chaque glande mammaire de souris comprend un arbre canalaire bordé de cellules épithéliales avec une seule ouverture à l’extrémité du mamelon. Cette structure rend les cellules épithéliales mammaires facilement accessibles aux vecteurs viraux, qui peuvent être délivrés dans la lumière d’un arbre canalaire par injection intracanalaire¹.

La technique d’injection intracanalaire mammaire était à l’origine utilisée pour des animaux beaucoup plus gros tels que les chèvres, les lapins et les rats¹. Pour un animal beaucoup plus petit comme les souris, l’injection intracanalaire nécessite de nombreux outils délicats et plus de pratiques de la part des opérateurs. Il existe deux approches pour l’injection intracanalaire chez la souris. L’un est l’injection de trayons¹. Une autre est l’injection directe du canal primaire de la glande mammaire #3 ou #4 après une exposition chirurgicale¹. Étant donné que la première est non invasive et plus rapide une fois que l’opérateur a été bien formé, cette technique est plus couramment utilisée et sera décrite en détail dans cet article.

Par rapport aux modèles murins transgéniques traditionnels largement utilisés, dans lesquels le gène d’intérêt est introduit au stade des œufs fécondés par microinjection ^2,3,4, l’administration de gènes par la méthode d’injection intracanalaire du virus présente de nombreux avantages, notamment: (1) elle évite le processus fastidieux de fabrication d’une lignée de souris transgénique pour chaque gène d’intérêt; 2° elle évite une altération potentielle du développement normal des glandes mammaires imposée par le gène d’intérêt; (3) il introduit le gène d’intérêt à tout moment désiré après la naissance; (4) il peut facilement co-introduire plus d’un gène d’intérêt; (5) il imite mieux le processus tumorigène naturel parce que les cellules infectées et donc porteuses d’oncogènes sont entourées de cellules normales; et (6) en combinaison avec la technologie TVA (tumor virus A, une protéine de surface des cellules aviaires et le récepteur du vecteur RCAS^{rétroviral) 5}, le gène d’intérêt peut être introduit dans une population cellulaire spécifique pour étudier l’origine cellulaire de la tumorigenèse et effectuer des essais de traçage de la lignée cellulaire dans les glandes mammaires 6,7,8^{, 9}.

Tout vecteur dérivé du rétrovirus¹⁰, du lentivirus 11,12^, de l’adénovirus 13 et du virus associé à l’adénovirus (AAV)¹⁴ peut être utilisé pour l’administration intracanalaire de matériel génétique. Les vecteurs rétrovirus et lentivirus s’intègrent de façon permanente dans le génome de l’hôte; Ainsi, ils introduisent des gènes d’intérêt de manière stable dans les cellules épithéliales mammaires. Alors que le lentivirus peut s’intégrer dans le génome de n’importe quelle cellule qu’il rencontre¹⁵, l’intégration génomique efficace du rétrovirus nécessite la prolifération des cellules cibles¹⁶. Les vecteurs adénoviraux et AAV ne s’intègrent pas dans le génome des cellules infectées et, par conséquent, n’expriment que transitoirement le gène d’intérêt^17,18. Cette caractéristique peut être un avantage lorsque le gène d’intérêt n’a besoin d’être exprimé que pendant une courte période, comme Cre, pour supprimer un gène suppresseur de tumeur floxed.

Le lentivirus, l’adénovirus et l’AAV infectent toutes les cellules de souris qu’ils rencontrent. Mais comme l’épithélium luminal est en grande partie isolé de la couche basale sous-jacente, qui est en outre séparée du stroma par la membrane basale, l’injection intracanalaire limite l’infection en grande partie aux cellules épithéliales luminales, la cellule primaire d’origine du cancer du sein. Dans cette couche épithéliale luminale, il existe également des sous-types cellulaires distincts, notamment des cellules souches, des cellules progénitrices et plusieurs groupes de cellules différenciées. Pour infecter des sous-ensembles cellulaires spécifiques au sein de la population de cellules luminales, la technologie TVA peut être utilisée, avec laquelle les vecteurs RCAS dérivés du virus de la leucose aviaire^5,10 ou les vecteurs lentiviraux pseudotypés¹¹ infectent sélectivement les cellules qui expriment la TVA chez les souris porteuses d’un transgène tva sous le contrôle d’un promoteur spécifique au type cellulaire, tel qu’un promoteur actif uniquement dans les cellules souches 6 ou certains progéniteurs ^{6, 7} ou cellules alvéolaires⁸ ou cellules actives de la voie Wnt⁹.

Ce protocole présente la technique d’introduction de gènes d’intérêt dans les cellules épithéliales mammaires par injection intracanalaire d’un vecteur viral. La détection de l’expression des gènes introduits et des lésions hyperplasiques et tumeurs qui en résultent est alors démontrée.

Protocole

Toutes les procédures utilisant des souris ont été effectuées conformément au protocole sur les animaux approuvé par le Comité de soin et d’utilisation des animaux en établissement. Pour la présente étude, des souris femelles FVB/N ou MMTV-tva âgées de 9 à 12 semaines ont été utilisées. Les souris ont été obtenues commercialement ou fabriquées par elles-mêmes (voir le tableau des matériaux). Les virus Lenti-EGFP (FUCGW) et RCAS-Erbb2 (Neu) ont été utilisés. La préparation du virus et la détermination des titres ont été effectuées à la suite des rapports publiés précédemment^10,12.

1. Préparation de la seringue

1. Couper les aiguilles de moyeu métallique de 33 G (voir le tableau des matériaux) à environ 1 cm de longueur. Conservez les aiguilles et la seringue de 50 μL dans de l’alcool à 70 % après l’autoclavage.
2. Sortez les seringues et les aiguilles de l’alcool. Propulsez l’alcool restant hors de la seringue et de l’aiguille. Démontez la seringue pour sécher à l’air sur un tampon de banc absorbant autoclavé.
3. Assemblez la seringue après séchage.

2. Préparation du virus

1. Sortez un ou plusieurs tubes de stock viraux au besoin du congélateur à -80 °C et décongelez le virus sur la glace.
   REMARQUE: Selon le nombre de cellules à infecter, le virus peut avoir besoin d’être dilué dans les titres prévus en utilisant 1x PBS à ce stade.
2. Ajouter le bleu de bromophénol en plongeant l’embout de la pipette à une profondeur de 1 cm dans la poudre de bleu de bromophénol (voir le tableau des matériaux). Ensuite, apportez l’infime de bleu de bromophénol attaché dans la suspension virale.
   REMARQUE : Pour la présente étude, le stock viral est habituellement de 200 μL par tube, de sorte que la concentration finale de colorant est d’environ 0,2 % (0,2 μg/100 μL). Le bleu de bromophénol doit être stérilisé par rayonnement micro-ondes pendant 45 secondes à haute puissance de 1250 W (voir le tableau des matériaux). Assurez-vous de mener toute la procédure dans un environnement stérile.
3. Mélanger le bleu de bromophénol avec la solution virale en pipetant de haut en bas 10 fois.
4. Placez le virus sur la glace et apportez le seau à glace au vivarium.

3. Préparation des animaux

1. Anesthésier une souris femelle par injection intrapéritonéale de 2 μL/g d’anesthésique (37,6 mg/mL de kétamine, 1,92 mg/mL de xylazine et 0,38 mg/mL d’acépromazine, voir le tableau des matières). Vérifiez la profondeur de l’anesthésie avec un pincement d’orteil. Appliquez une pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
   REMARQUE: La souris doit ne pas répondre au pincement des orteils sous une bonne anesthésie. L’isoflurane peut également être utilisé pour anesthésier les souris.
2. Placez la souris en décubitus dorsal sur un coussin chaud et fixez les quatre membres au banc à l’aide de ruban adhésif.
3. Identifier un mamelon (ou plus) à injecter (le numéro 4 est préféré pour la présente étude). Exposez-le en coupant les cheveux environnants à l’aide d’une paire de ciseaux.
4. Appliquez des tampons d’alcool et d’iodophor à 70% sur la zone du mamelon en trois tours pour nettoyer et exposer le mamelon.

4. Injection intracanalaire de virus

REMARQUE: Une lampe grossissante peut être utilisée pour aider à visualiser l’ouverture du mamelon.

1. Transecter l’extrémité distale d’un mamelon à l’aide d’une paire de ciseaux à ressort à microdissection stériles, jusqu’à ce qu’une petite ouverture canalaire centrale puisse être vue sous une loupe (voir Tableau des matériaux).
2. Charger 10 μL de mélange virus/bleu de bromophénol dans la seringue.
   REMARQUE : Lenti-EGFP (FUCGW) et RCAS-Erbb2 (Neu) sont utilisés dans cette démonstration.
3. Insérez soigneusement l’aiguille dans l’ouverture du mamelon à l’aide de la loupe. L’orientation de l’aiguille est légèrement ajustée de la médiale à la latérale pour s’aligner avec le conduit principal.
4. Injectez la totalité des 10 μL du virus dans le conduit.
   REMARQUE: Les canaux sous la peau doivent devenir bleus, si l’injection réussit. Toute résistance ou apparition d’un changement de couleur localisé indique l’échec de l’injection.
5. Placez la souris sur un chauffe-diapositive réglé à 45 °C jusqu’à ce que la souris se réveille complètement (~30-60 min).

5. Détection de cellules infectées par stéréomicroscope fluorescent

1. Trois à cinq jours après l’injection du virus porteur de la GFP ou d’autres gènes fluorescents, euthanasier la souris en la surdosant avec 4 uL/g d’anesthésique (37,6 mg/mL de kétamine, 1,92 mg/mL de xylazine et 0,38 mg/mL d’acépromazine).
2. Ouvrez la cavité thoracique. Couper la peau le long de la ligne médiane ventrale et le long des membres supérieurs et inférieurs à l’aide d’une paire de ciseaux. Soulevez la peau et exposez les glandes mammaires.
3. Retirez la glande mammaire injectée de la peau à l’aide d’une pince et de ciseaux. En outre, retirez une glande non injectée comme témoin.
4. Placez les glandes mammaires sur des lames de verre et étalez les glandes à leur forme originale.
5. Observez et imagez les glandes sous un stéréomicroscope fluorescent.

Résultats

Des données représentatives sont présentées ici pour démontrer une injection intracanalaire réussie, une infection virale réussie et l’impact des gènes délivrés sur la tumorigenèse mammaire. La quantité de virus injectée doit être adaptée à l’objectif de chaque expérience. Pour illustrer à quel point l’arbre mammaire peut être infecté, une grande quantité de gènes porteurs de virus pouvant être imagés, tels que la GFP, doit être utilisée. D’autre part, pour imiter la tumorigenèse sponta...

Discussion

Cet article démontre la technique d’injection intracanalaire virale pour introduire des gènes dans les cellules épithéliales mammaires de souris pour modéliser le cancer du sein sporadique. Habituellement, des souris d’au moins 5 semaines ou plus sont injectées afin que le processus oncogénique commence après le développement de la glande mammaire. En outre, l’ouverture du mamelon des souris de moins de 5 semaines est souvent trop petite pour l’injection. D’autre part, les mamelons de souris très âg?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-HA antibody	Covance	MMS-101P	Dilution: 1 : 1000
Artificial Tears	Covetrus	NDC 11695-0832-1
Bromophenol blue	Sigma	B5525	microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven
FACSCantoII	BD Biosciences	V96100899
Fluorescent stereomicroscope	Leica	MZ16 FA
FUCGW lenti-virus	Self-made	N/A	See reference # 12
FVB/N	The Jackson Laboratory	JAX:001800
Hamilton needle	Hamilton	91033	autoclaved
Hamilton syringe	Hamilton	201000	autoclaved
LED magnifying lamp	Intertek	3165273
Micro dissection spring scissor	Roboz	RS-5621	autoclaved
MMTV-tva	Self-made		See reference # 10
RCAS-Neu (HA)	Self-made	N/A	See reference # 10
Rodent Comboanesthetic III	Veterinary Pharmacy	Veterinary prescription	37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine