مراقبة بسيطة مستمرة للجلوكوز في الفئران التي تتحرك بحرية

Summary

هنا ، نصف طريقة بسيطة لزرع جهاز مراقبة الجلوكوز المستمر التجاري المصمم للمرضى على الفئران وتوفير البرامج النصية لتحليل النتائج.

Abstract

الفئران هي كائن نموذجي شائع يستخدم لدراسة الأمراض الأيضية مثل داء السكري. عادة ما يتم قياس مستويات الجلوكوز عن طريق نزيف الذيل ، والذي يتطلب التعامل مع الفئران ، ويسبب الإجهاد ، ولا يوفر بيانات عن الفئران التي تتصرف بحرية خلال الدورة المظلمة. يتطلب قياس الجلوكوز المستمر المتطور في الفئران إدخال مسبار في قوس الأبهر للفأر ، بالإضافة إلى نظام قياس عن بعد متخصص. لم يتم اعتماد هذه الطريقة الصعبة والمكلفة من قبل معظم المختبرات. هنا ، نقدم بروتوكولا بسيطا يتضمن استخدام أجهزة مراقبة الجلوكوز المستمرة المتاحة تجاريا والتي يستخدمها ملايين المرضى لقياس الجلوكوز بشكل مستمر في الفئران كجزء من البحث الأساسي. يتم إدخال مسبار استشعار الجلوكوز في الفضاء تحت الجلد في الجزء الخلفي من الماوس من خلال شق صغير في الجلد ويتم تثبيته في مكانه بإحكام باستخدام بضع غرز. يتم خياطة الجهاز على جلد الفأر لضمان بقائه في مكانه. يمكن للجهاز قياس مستويات الجلوكوز لمدة تصل إلى 2 أسابيع ويرسل البيانات إلى جهاز استقبال قريب دون الحاجة إلى التعامل مع الفئران. يتم توفير البرامج النصية لتحليل البيانات الأساسية لمستويات الجلوكوز المسجلة. هذه الطريقة ، من الجراحة إلى التحليل الحسابي ، فعالة من حيث التكلفة ويحتمل أن تكون مفيدة جدا في أبحاث التمثيل الغذائي.

Introduction

داء السكري (DM) هو مرض مدمر يتميز بارتفاع مستويات الجلوكوز في الدم. يمكن أن يكون النوع 1 DM نتيجة لهجوم المناعة الذاتية على خلايا بيتا المنتجة للأنسولين في البنكرياس. من ناحية أخرى ، يتميز النوع 2 DM و DM الحملي بفشل خلايا بيتا في إفراز كمية كافية من الأنسولين استجابة لارتفاع مستويات الجلوكوز¹. الفأر هو كائن نموذجي شائع يستخدم لدراسة DM لأنه يحتوي على فسيولوجيا مماثلة ، ومستويات الجلوكوز الطبيعية قريبة من مستويات البشر. علاوة على ذلك ، قد تصاب سلالات معينة من الفئران ب DM بسبب الطفرات في مسارات الإشارات الرئيسية أو بعد التعرض لأنظمة غذائية محددة ، مما يتيح نمذجة المرض²،^3،4.

يتم قياس نسبة الجلوكوز في الدم عادة في الفئران باستخدام أجهزة قياس السكر المصممة للمرضى عن طريق استخراج قطرة صغيرة من الدم (1-2 ميكرولتر) من طرف ذيل الفأر. تسبب هذه الطريقة الإجهاد وتتطلب التعامل مع الفأر ، مما يؤثر على مستويات الجلوكوز ويحظر قياس مستويات الجلوكوز في الدم في الفئران التي تتصرف بحرية أو عندما لا يكون الباحث قريبا من⁵. قد يسبب نزيف الفئران إجهادا للفئران القريبة ، وخاصة الفئران من نفس القفص التي لم يتم قياس نسبة السكر في الدم لديها بعد ، مما يؤثر على النتائج. تستجيب الفئران بشكل مختلف اعتمادا على المعالج ، وقد يؤثر الشخص الذي يقيس الجلوكوز على مستويات الجلوكوز في الفئران. تتطلب هذه المزالق تصميما تجريبيا دقيقا وتكمن وراء بعض التناقضات بين التجارب.

من الممكن قياس الجلوكوز في الفئران التي تتحرك بحرية دون نزيف عن طريق زرع مستشعرات الجلوكوز في قوس الأبهر للفئران باستخدام أحدث القياس عن بعد⁶. القياسات الناتجة جيدة جدا ويمكن أن تستمر على مدى فترة طويلة ، ولكن من الصعب زرع هذه المستشعرات ، ونظام القياس عن بعد مكلف ، مما يؤدي إلى اعتماد معتدل لهذه المنهجية وعدم اعتمادها في المختبرات غير المتخصصة. تم تطوير مستشعرات الجلوكوز تحت الجلد أو غيرها من أجهزة استشعار الجلوكوز المصممة خصيصا لأبعاد الفئران وعلم وظائف الأعضاء في السنوات الأخيرة ، ولكن هذه تتطلب مرة أخرى خبراء ذوي مهارات عالية وفي بعض الحالات تكون مكلفة⁶،⁷،⁸،^9،10.

توفر أجهزة مراقبة الجلوكوز المستمرة التجارية (CGMs) التي تم تطويرها في الأصل لمراقبة مستويات الجلوكوز لمرضى DM خيارا آخر لقياس الجلوكوز في الفئران التي تتحرك بحرية ، بتكلفة أقل ومتطلبات خبرة فنية من المجسات المزروعة. تم استخدام هذه المجسات في الأبحاث الأساسية من قبل عدد قليل من المختبرات⁵،11،12،13،^14،15 بما في ذلك زملائنا الذين استخدموا هذا البروتوكول ¹⁶. تتضمن هذه الأجهزة عادة مستشعرا وجهاز تركيب وجهاز استقبال وتطبيقا برمجيا. يحتوي المستشعر على قنية توجه مستشعر الجلوكوز الأنزيمي ، وشريط لاصق ، ومصدر طاقة ، وذاكرة قصيرة المدى ، ووحدة اتصال لاسلكية تخزن البيانات وترسلها إلى جهاز الاستقبال. يمكن لجهاز الاستقبال إظهار مستويات الجلوكوز الحالية وإرسال البيانات إلى الخادم ؛ يمكن أن يكون جهاز الاستقبال هذا هاتفا محمولا. يوفر تطبيق البرنامج بيانات للمريض وفريق الرعاية الطبية حول نسبة السكر في الدم للمريض. في المرضى ، يتم توصيل المستشعر بسهولة باستخدام جهاز التركيب. يتم إدخال القنية تحت الجلد عن طريق الضغط على جهاز التثبيت على الجلد ، ويبقى المستشعر في مكانه بمساعدة شريط لاصق.

هذا بروتوكول مفصل لتكييف جهاز CGM تجاري لقياس مستويات الجلوكوز في الفئران. يصف هذا البروتوكول كيفية إدخال مستشعر الجلوكوز جراحيا وإرفاقه بالماوس. يتم توفير البرامج النصية لتحليل البيانات الأساسية وتصور البيانات. يتم توفير المزالق المحتملة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها وأمثلة على النتائج القياسية. البروتوكول أدناه خاص ب CGM معين ولكن يمكن تكييفه بسهولة مع أنواع أخرى من CGMs التجارية عند توفرها.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على التجارب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في الجامعة العبرية (IACUC).

ملاحظة: يجب تعقيم جميع الأدوات ، ويجب إجراء التعامل مع القنية باستخدام تقنية معقمة. يتم ضبط البروتوكول أدناه بدقة على CGM محدد. يمكن تكييف البروتوكول مع CGMs الأخرى.

1. إعطاء مسكن قبل الإجراء

1. يتم تطبيق 5٪ دكستروز ومحلول ملحي 0.45٪ مع ميلوكسيكام عند تناول 5 ملغ/ كغ من وزن الجسم تحت الجلد.

2. إدارة التخدير

1. ضع الماوس في غرفة الحث ، وأغلق الغطاء بإحكام. اضبط تحريض التخدير في غرفة الحث على 3٪ إيزوفلوران بمعدل تدفق 500 مل / دقيقة.
2. بمجرد عدم استجابة الماوس ، قم بإزالة الماوس من الحجرة ، وقم بتركيب مخروط الأنف على الماوس. تأكيد مستوى التخدير مع قرصة بين الأصابع. اضبط التركيز على 1٪ -1.5٪ إيزوفلوران ومعدل التدفق على 100 مل / دقيقة في فأر يزن 30 جم.
3. ضع مرهم العيون على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.

3. إعداد أجهزة الاستشعار

1. قم بتركيب المستشعر على جهاز تركيب المستشعر لكشف شريط المستشعر وجانب القنية (الشكل 1 أ). كن حذرا حيث يتم إدخال الإبرة في القنية وتعريضها.
2. خياطة اثنين من الغرز نقطة تفتق 5-0 على الشريط على جانبي القنية (الشكل 1 أ).

4. إزالة الشعر وتطهيره

1. احلق مساحة حوالي 4 سم × 4 سم على خط الوسط من الجزء الخلفي من الماوس.
2. ضع كريم مزيل الشعر على المنطقة المحلوقة لضمان إزالة الشعر بالكامل.
3. امسح الجلد وقم بتطهيره باستخدام محلول مطهر يحتوي على 2٪ غلوكونات الكلورهيكسيدين و 70٪ كحول الأيزوبروبيل.

5. إعداد الجلد الظهري

1. قم بعمل شق 2 مم في وسط المنطقة المحلوقة فوق العمود الفقري باستخدام مقص حاد (الشكل 1 ب).
2. باختصار ، أدخل ملقط صغير بحافة حادة تحت الجلد لتشكيل جيب صغير تحت الجلد بحيث يمكن إدخال القنية بسهولة في الجيب تحت الجلد (الشكل 1 ب).
3. مرر خياطة من الخطوة 3.2 عبر الجلد على كل جانب من الشق (الشكل 1 ج).

6. إدخال المستشعر

1. قم بإزالة المستشعر تماما من جهاز تركيب المستشعر (القنية خالية من الإبرة) ، وأمسك المستشعر بالملقط لمنع الشريط المحيط من الالتصاق بنفسه.
2. أدخل القنية بعناية في الجيب تحت الجلد.
3. اسحب الغرز على كل جانب ، وشدها واربطها لتثبيت المستشعر بإحكام في مكانه ، وبالتالي منع القنية من الانزلاق من الجيب تحت الجلد بمجرد فك الشريط اللاصق بمرور الوقت.

7. مرفق الاستشعار والخياطة

1. قم بتوصيل المستشعر بالظهر بإحكام عن طريق ربط الغرز الداخلية واستخدام الشريط اللاصق المحيط بالمستشعر.
2. قم بعمل ثماني خيوط متقطعة حول المستشعر ، مع ربط حدود شريط المستشعر بالجلد (الشكل 1 د).

8. تفعيل القارئ

1. بمجرد إدخال المستشعر ، قم بتنشيط القارئ عن طريق تشغيل القارئ ، والضغط على Start New Sensor ، وتمرير المستشعر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. لا يمكن أخذ القراءة الأولى إلا بعد بضع دقائق من تثبيت CGM. في حالة CGM ، يمكن أخذ القراءة الأولى بعد 60 دقيقة.

9. قراءة النتائج

1. ضع القارئ بالقرب من الماوس (ليست هناك حاجة للمسه). يتم إرسال جميع البيانات المخزنة في المستشعر إلى القارئ.
   ملاحظة: قد تختلف أجهزة المراقبة المستمرة للسكري المختلفة في فترة سعة توفير البيانات التاريخية. في حالة CGM ، يمكن تخزين 8 ساعات كحد أقصى بين قراءتين.

10. إزالة المستشعر

1. تخدير الفأر (انظر القسم 2).
2. قطع الغرز التي تربط المستشعر بالجزء الخلفي من الماوس باستخدام مقص حاد.
3. قم بإزالة وقطع الغرز في الشق عن طريق إزالة المستشعر برفق.
4. إذا لزم الأمر ، استخدم خياطة واحدة لإغلاق الشق في الجزء الخلفي من الماوس.

11. تحليل البيانات

1. تنزيل البيانات: قم بتنزيل البيانات وفقا للإرشادات المقدمة من الشركة المصنعة للمراقبة المستمرة للسكري (CGM).
   ملاحظة: يحتوي كل CGM على تنسيق مختلف ، والذي قد يكون أو لا يكون سهل الوصول إليه للمستخدم. هذا اعتبار مهم في اختيار CGM.
2. للتحليل باستخدام البرنامج المقدم ، قم بتنسيق البيانات وفقا للإرشادات الواردة في الملف التمهيدي على Github (https://github.com/mika-littor/CGM-in-Mice-Analysis.git).

الشكل 1: ربط المستشعر بالماوس . (أ) يتم تمرير خيطين مميزين بسهمين أحمرين عبر شريط المستشعر الموجود على جانبي القنية على الجانب السفلي من مستشعر المراقبة المستمرة للسكري ، مع تمييزهما بسهم أبيض. (ب) يجرى شق صغير مقص 2 مم في وسط المنطقة المحلوقة على طول العمود الفقري باستخدام مقص حاد. يتم إدخال ملقط صغير ذو حافة حادة لفترة وجيزة تحت الجلد لتشكيل جيب صغير تحت الجلد بحيث يمكن إدخال القنية تحت الجلد. (ج) تمرر الغرز نفسها من (أ ) تحت الجلد على كل جانب من الشق. تشير الأسهم الحمراء إلى الغرز المتصلة بالمستشعر كما في A ، وتحدد الأسهم الزرقاء الموقع الذي مرت فيه الغرز إلى الجلد في الجزء الخلفي من الماوس ، ويظهر السهم الأسود الشق. (د) بعد إدخال القنية، يتم شد الغرز الداخلية وربطها بالقرب من الشق لتثبيت المراقبة المستمرة للجوى. ثم يتم خياطة المستشعر على الجلد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

النتائج الجراحية
النتائج من ثمانية HSD: ICR الفئران (الذين تتراوح أعمارهم بين 8 أسابيع) تغذت على نظام غذائي عالي الدهون عالية السكروز (HFHS) لمدة 18 أسبوعا وخمسة HSD: الفئران ICR العجاف (الذين تتراوح أعمارهم بين 12 أسبوعا) موضحة. يخزن الجهاز الذي استخدمناه البيانات لمدة تصل إلى 8 ساعات. تم تق?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة وغير مكلفة لمراقبة مستويات الجلوكوز في الفئران التي لا تتطلب جراحة مجهرية صعبة ولا تنطوي على نزيف أو التعامل مع الفئران. هذه الطريقة سهلة التنفيذ في كل منشأة ولا تسبب الوفيات أو الألم أو الانزعاج المفرط للفئران. الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي إدخال ق?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2%  Chlorhexidine Gluconate and 70%  Isopropyl Alcohol	3M	ID 7000136290
5% Dextrose and 0.45% Sodium Chloride Injection, USP	Braun	L6120
Castroviejo needle holder	FST	12061-02
Extra Fine Bonn scissors	FST	14084-08
FreeStyle Libre 1 reader	Abbott	ART27543
FreeStyle Libre sensor	Abbott	ART36687
FreeStyle Libre sensor applicator	Abbott	ART36787
Gauze pads	Sion medical	PC912017
Graefe Forceps	FST	11052-10
Hair Removal Cream	Veet	3116523
High-fat high-sucrose diet	Envigo Teklad diets	TD.08811
Isoflurane, USP Terrell	Piramal	26675-46-7
Meloxicam 5 mg/mL	Chanelle Pharma	08749/5024
MiniARCO Clipper kit	Moser	CL8787-KIT
PROLENE Polypropylene Suture 5-0	Ethicon	8725H
Puralube Opthalmic Ointment	Perrigo	574402511
Q-tips	B.H.W	271676
SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System	Kent Scientific	SOMNO