Простой непрерывный мониторинг уровня глюкозы у свободно движущихся мышей

Резюме

Здесь мы описываем простой метод имплантации мышам коммерческого непрерывного монитора глюкозы, предназначенного для пациентов, и предоставляем сценарии для анализа результатов.

Аннотация

Мыши являются распространенным модельным организмом, используемым для изучения метаболических заболеваний, таких как сахарный диабет. Уровни глюкозы обычно измеряются с помощью кровотечения из хвоста, которое требует обращения с мышами, вызывает стресс и не дает данных о свободно ведущих себя мышах во время темного цикла. Современное непрерывное измерение уровня глюкозы у мышей требует введения зонда в дугу аорты мыши, а также специализированной системы телеметрии. Этот сложный и дорогостоящий метод не был принят большинством лабораторий. Здесь мы представляем простой протокол, включающий использование коммерчески доступных непрерывных мониторов глюкозы, используемых миллионами пациентов для непрерывного измерения глюкозы у мышей в рамках фундаментальных исследований. Зонд, чувствительный к глюкозе, вводится в подкожное пространство в задней части мыши через небольшой разрез на коже и плотно удерживается на месте с помощью пары швов. Устройство пришивается к коже мыши, чтобы оно оставалось на месте. Устройство может измерять уровень глюкозы в течение 2 недель и отправляет данные на ближайший приемник без необходимости обращаться с мышами. Приведены сценарии для анализа основных данных зарегистрированных уровней глюкозы. Этот метод, от хирургии до вычислительного анализа, является экономически эффективным и потенциально очень полезным в метаболических исследованиях.

Введение

Сахарный диабет (СД) – разрушительное заболевание, характеризующееся высоким уровнем глюкозы в крови. СД 1 типа может быть результатом аутоиммунной атаки на инсулин-продуцирующие бета-клетки поджелудочной железы. СД 2 типа и гестационный СД, с другой стороны, характеризуются неспособностью бета-клеток секретировать достаточное количество инсулина в ответ на повышение уровня глюкозы¹. Мышь является распространенным модельным организмом, используемым для изучения СД, поскольку она имеет схожую физиологию, а ее нормальный уровень глюкозы близок к человеческому. Кроме того, у конкретных линий мышей может развиться СД из-за мутаций в ключевых сигнальных путях или после воздействия определенных диет, что позволяет моделировать заболевание ^2,3,4.

Уровень глюкозы в крови обычно измеряется у мышей с помощью глюкометров, предназначенных для пациентов, путем извлечения небольшой капли крови (1-2 мкл) из кончика хвоста мыши. Этот метод вызывает стресс и требует обращения с мышью, что влияет на уровень глюкозы и запрещает измерение уровня глюкозы в крови у свободно ведущих себя мышей или когда исследователь не находится рядом на⁵. Кровотечение у мышей может вызвать стресс у ближайших мышей, особенно у мышей в той же клетке, гликемия которых еще не измерена, что влияет на результаты. Мыши реагируют по-разному в зависимости от обработчика, и человек, измеряющий глюкозу, может влиять на уровень глюкозы у мышей. Эти подводные камни требуют тщательного планирования экспериментов и лежат в основе некоторых несоответствий между экспериментами.

Можно измерить уровень глюкозы у свободно движущихся мышей без кровотечения путем имплантации датчиков глюкозы в дугу аорты мышей с использованием современной телеметрии⁶. Полученные измерения очень хороши и могут поддерживаться в течение длительного периода, но имплантировать эти датчики сложно, а система телеметрии стоит дорого, что приводит к умеренному принятию этой методологии и отсутствию ее принятия в неспециализированных лабораториях. В последние годы были разработаны подкожные или другие датчики глюкозы, адаптированные к размерам мышей и их физиологии, но они снова требуют высококвалифицированных специалистов и в некоторых случаях являются дорогостоящими 6,7,8,9,10.

Коммерческие непрерывные мониторы глюкозы (CGM), которые первоначально были разработаны для мониторинга уровня глюкозы у пациентов с СД, предлагают еще один вариант измерения глюкозы у свободно движущихся мышей с более низкой стоимостью и техническими требованиями, чем имплантированные зонды. Такие зонды использовались в фундаментальных исследованиях несколькими лабораториями 5,11,12,13,14,15, включая наших коллег^, которые использовали этот протокол ¹⁶. Эти устройства обычно включают датчик, монтажное устройство, приемник и программное обеспечение. Датчик имеет канюлю, направляющую ферментативный глюкосенсор, клейкую ленту, источник энергии, кратковременную память и модуль беспроводной связи, который хранит и отправляет данные на приемник. Приемник может показывать текущие уровни глюкозы и отправляет данные на сервер; Этот приемник может быть мобильным телефоном. Программное приложение предоставляет данные для пациента и медицинской бригады о гликемии пациента. У пациентов датчик легко крепится с помощью крепежного устройства. Канюля вводится подкожно, прижимая крепежное устройство к коже, а датчик остается на месте с помощью клейкой ленты.

Это подробный протокол адаптации коммерческого устройства CGM для измерения уровня глюкозы у мышей. Этот протокол описывает, как хирургическим путем вставить датчик глюкозы и прикрепить его к мыши. Предусмотрены скрипты для базового анализа и визуализации данных. Приведены возможные подводные камни, устранение неполадок и примеры стандартных результатов. Приведенный ниже протокол специфичен для определенного CGM, но может быть легко адаптирован к другим типам коммерческих CGM по мере их появления.

протокол

Эксперименты были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Еврейского университета.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все инструменты должны быть стерилизованы, а обращение с канюлей должно выполняться с использованием стерильной техники. Приведенный ниже протокол точно настроен для конкретного CGM. Протокол может быть адаптирован к другим CGM.

1. Введение анальгетика перед процедурой

1. Вводят 5% декстрозу и 0,45% физиологический раствор с мелоксикамом в дозе 5 мг / кг массы тела подкожно.

2. Введение анестезии

1. Поместите мышь в индукционную камеру, плотно закрыв крышку. Установите индукцию анестезии в индукционной камере на 3% изофлурана при скорости потока 500 мл/мин.
2. Как только мышь перестанет отвечать, извлеките мышь из камеры и прикрепите носовой конус к мыши. Подтвердите уровень анестезии межпальцевым щипцом. Установите концентрацию 1%-1,5% изофлурана и скорость потока 100 мл/мин у мыши весом 30 г.
3. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.

3. Подготовка датчика

1. Установите датчик на устройство крепления датчика, чтобы обнажить ленту датчика и сторону канюли (рис. 1A). Будьте осторожны, так как игла вставляется в канюлю и обнажается.
2. Наложите два конических шва 5-0 на ленту с обеих сторон канюли (рис. 1А).

4. Эпиляция и дезинфекция

1. Побрейте область примерно 4 см х 4 см по средней линии спины мыши.
2. Нанесите крем для депиляции на выбритую область, чтобы обеспечить полное удаление волос.
3. Протрите кожу и продезинфицируйте ее с помощью антисептического раствора, содержащего 2% хлоргексидина глюконата и 70% изопропилового спирта.

5. Подготовка спинной кожи

1. Сделайте разрез 2 мм в центре выбритого участка над позвоночником с помощью острых ножниц (рис. 1B).
2. Вкратце, вставьте небольшие щипцы с тупым краем под кожу, чтобы сформировать небольшой подкожный карман, чтобы канюлю можно было легко вставить в подкожный карман (рис. 1B).
3. Проведите шов, начиная с шага 3.2, через кожу с каждой стороны разреза (рис. 1C).

6. Вставка датчика

1. Полностью извлеките датчик из устройства крепления датчика (канюля пуста от иглы) и удерживайте датчик щипцами, чтобы окружающая лента не прилипала к себе.
2. Аккуратно вставьте канюлю в подкожный карман.
3. Натяните швы с каждой стороны, затяните и завяжите их, чтобы надежно закрепить датчик на месте, тем самым предотвращая выскальзывание канюли из подкожного кармана после того, как клейкая лента со временем ослабнет.

7. Крепление и наложение швов на датчик

1. Плотно прикрепите датчик к задней части, завязав внутренние швы и используя клейкую ленту, окружающую датчик.
2. Наложите восемь прерывистых швов вокруг датчика, прикрепив границу ленты датчика к коже (рис. 1D).

8. Активация считывателя

1. После того, как датчик будет вставлен, активируйте считыватель, включив считыватель, нажав « Начать новый датчик» и проведя пальцем по датчику в соответствии с инструкциями производителя.
2. Первое чтение можно сделать только через несколько минут после установки CGM. В случае этого CGM первое чтение может быть снято через 60 минут.

9. Результаты считывания

1. Поместите считыватель близко к мыши (прикасаться к нему не нужно). Все данные, хранящиеся в датчике, передаются на считыватель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Различные устройства CGM могут отличаться по периоду исторической емкости сохранения данных. В случае этого CGM между двумя показаниями может храниться не более 8 часов.

10. Снятие датчика

1. Обезболить мышь (см. раздел 2).
2. Разрежьте швы, соединяющие датчик с задней частью мыши, с помощью острых ножниц.
3. Снимите и разрежьте швы на разрезе, аккуратно извлекли датчик.
4. При необходимости используйте один шов, чтобы закрыть разрез в задней части мыши.

11. Анализ данных

1. Загрузка данных: Загрузите данные в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем CGM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый CGM имеет свой формат, который может быть или не быть легко доступным для пользователя. Это важное соображение при выборе CGM.
2. Для анализа с помощью предоставленного программного обеспечения отформатируйте данные в соответствии с инструкциями в файле readme на Github (https://github.com/mika-littor/CGM-in-Mice-Analysis.git).

Рисунок 1: Крепление датчика к мыши . (A) Два шва, отмеченные красными стрелками, пропускаются через сенсорную ленту с обеих сторон канюли на нижней стороне датчика CGM, отмеченного белой стрелкой. (B) Острыми ножницами в центре бритой области вдоль позвоночника делается небольшой разрез толщиной 2 мм. Небольшие щипцы с тупым краем ненадолго вставляются под кожу, образуя небольшой подкожный карман, чтобы канюлю можно было вводить подкожно. (C) Те же швы из А накладываются подкожно с каждой стороны разреза. Красные стрелки отмечают швы, прикрепленные к датчику, как показано в A, синие стрелки отмечают место, где швы прошли через кожу в задней части мыши, а черная стрелка показывает разрез. (D) После того, как канюля вставлена, внутренние швы затягиваются и завязываются близко к разрезу, чтобы закрепить CGM. Затем датчик пришивается к коже. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

Исход операции
Показаны результаты восьми мышей HSD: ICR (в возрасте 8 недель), которых кормили диетой с высоким содержанием жиров и высоким содержанием сахарозы (HFHS) в течение 18 недель, и пяти постных мышей HSD: ICR (в возрасте 12 недель). Устройство, которое мы использовали, хранит дан?...

Обсуждение

Этот протокол предлагает простой, недорогой метод мониторинга уровня глюкозы у мышей, который не требует сложной микрохирургии и не связан с кровотечением или обращением с мышами. Метод прост в применении в каждом учреждении и не вызывает смертности, боли или чрезмерного дискомфорта у...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2%  Chlorhexidine Gluconate and 70%  Isopropyl Alcohol	3M	ID 7000136290
5% Dextrose and 0.45% Sodium Chloride Injection, USP	Braun	L6120
Castroviejo needle holder	FST	12061-02
Extra Fine Bonn scissors	FST	14084-08
FreeStyle Libre 1 reader	Abbott	ART27543
FreeStyle Libre sensor	Abbott	ART36687
FreeStyle Libre sensor applicator	Abbott	ART36787
Gauze pads	Sion medical	PC912017
Graefe Forceps	FST	11052-10
Hair Removal Cream	Veet	3116523
High-fat high-sucrose diet	Envigo Teklad diets	TD.08811
Isoflurane, USP Terrell	Piramal	26675-46-7
Meloxicam 5 mg/mL	Chanelle Pharma	08749/5024
MiniARCO Clipper kit	Moser	CL8787-KIT
PROLENE Polypropylene Suture 5-0	Ethicon	8725H
Puralube Opthalmic Ointment	Perrigo	574402511
Q-tips	B.H.W	271676
SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System	Kent Scientific	SOMNO