自由に動くマウスにおける簡単な連続グルコースモニタリング

要約

ここでは、患者向けに設計された市販の連続血糖モニターをマウスに移植する簡単な方法を説明し、結果を分析するためのスクリプトを提供します。

要約

マウスは、糖尿病などの代謝性疾患の研究に使用される一般的なモデル生物です。グルコースレベルは通常、尾部出血によって測定され、マウスの取り扱いを必要とし、ストレスを引き起こし、暗サイクル中の自由に行動するマウスに関するデータを提供しません。マウスの最先端の連続グルコース測定には、マウスの大動脈弓にプローブを挿入し、特殊なテレメトリシステムを使用する必要があります。この困難で費用のかかる方法は、ほとんどのラボで採用されていません。ここでは、基礎研究の一環として、何百万人もの患者がマウスでグルコースを継続的に測定するために使用する市販の連続グルコースモニターの利用を含む簡単なプロトコルを紹介します。グルコース感知プローブは、皮膚への小さな切開を通してマウスの背中の皮下空間に挿入され、いくつかの縫合糸を使用してしっかりと所定の位置に保持されます。デバイスはマウスの皮膚に縫合され、所定の位置に留まるようにします。このデバイスは、最大2週間のグルコースレベルを測定し、マウスを扱うことなく近くの受信機にデータを送信します。記録されたグルコースレベルの基礎データ分析のためのスクリプトが提供されています。この方法は、手術から計算分析まで、費用対効果が高く、代謝研究に非常に役立つ可能性があります。

概要

糖尿病(DM)は、高血糖値を特徴とする壊滅的な病気です。1型DMは、膵臓のインスリン産生ベータ細胞に対する自己免疫攻撃の結果である可能性があります。一方、2型DMおよび妊娠DMは、ベータ細胞がグルコースレベルの上昇に応答して十分なインスリンを分泌できないことを特徴としています¹。マウスは、生理機能が類似しており、その正常な血糖値がヒトに近いため、DMの研究に使用される一般的なモデル生物です。さらに、特定のマウス系統は、主要なシグナル伝達経路の突然変異または特定の食事への曝露後にDMを発症する可能性があり、これにより疾患モデリングが可能になります^2,3,4。

血糖値は、一般的に、マウスの尾の先端から少量の血液(1〜2μL)を抽出することによって患者用に設計されたグルコメーターを使用してマウスで測定されます。この方法はストレスを引き起こし、マウスの取り扱いを必要とし、血糖値に影響を与え、自由に行動するマウスや研究者が⁵に近づいていない場合の血糖値の測定を禁止します。マウスの出血は、近くのマウス、特に血糖がまだ測定されていない同じケージのマウスにストレスを引き起こし、結果に影響を与える可能性があります。マウスはハンドラーによって反応が異なり、グルコースを測定する人はマウスのグルコースレベルに影響を与える可能性があります。これらの落とし穴は慎重な実験計画を必要とし、実験間のいくつかの不整合の根底にあります。

最先端のテレメトリ⁶を使用して、マウスの大動脈弓にグルコースセンサーを埋め込むことにより、出血のない自由に動くマウスのグルコースを測定することができます。結果として得られる測定値は非常に良好で、長期間にわたって持続することができますが、これらのセンサーを埋め込むことは困難であり、テレメトリシステムは高価であるため、この方法論は適度に採用され、専門外のラボでは採用されません。マウスの寸法とその生理機能に合わせた皮下または他のグルコースセンサーが近年開発されていますが、これらもまた高度なスキルを持つ専門家を必要とし、場合によってはコストがかかります⁶、⁷、^8、9、10。

もともとDM患者の血糖値を監視するために開発された市販の連続血糖モニター(CGM)は、埋め込まれたプローブよりも低コストで技術的専門知識の要件で、自由に動くマウスでブドウ糖を測定する別のオプションを提供します。このようなプローブは、このプロトコル¹⁶を使用した我々の同僚を含むいくつかの研究室⁵、¹¹、^12、13、^14、15によって基礎研究に使用されている。これらのデバイスには、通常、センサー、取り付けデバイス、レシーバー、およびソフトウェアアプリケーションが含まれます。センサーには、酵素糖センサーをガイドするカニューレ、粘着テープ、エネルギー源、短期記憶、およびデータを保存して受信機に送信する無線通信モジュールがあります。受信機は現在の血糖値を表示し、データをサーバーに送信できます。この受信機は携帯電話にすることができます。ソフトウェアアプリケーションは、患者の血糖に関するデータを患者と医療チームに提供します。患者では、センサーは取り付け装置を使用して簡単に取り付けられます。カニューレは、取り付け装置を皮膚に押し付けることによって皮下挿入され、センサーは粘着テープの助けを借りて所定の位置に留まります。

これは、市販のCGMデバイスをマウスのグルコースレベルを測定するように適合させるための詳細なプロトコルです。このプロトコルでは、グルコースセンサーを外科的に挿入してマウスに取り付ける方法について説明します。基本的なデータ分析とデータ視覚化のためのスクリプトが用意されています。潜在的な落とし穴、トラブルシューティング、および標準結果の例が示されています。以下のプロトコルは特定のCGMに固有のものですが、他のタイプの商用CGMが利用可能になると簡単に適応させることができます。

プロトコル

実験は、ヘブライ大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。

注:すべてのツールは滅菌する必要があり、カニューレの取り扱いは滅菌技術を使用して実行する必要があります。以下のプロトコルは、特定のCGMに合わせて微調整されています。このプロトコルは、他のCGMに適合させることができます。

1.施術前の鎮痛投与

1. 5%デキストロースと0.45%生理食塩水をメロキシカムとともに5 mg / kg体重で皮下投与します。.

2.麻酔投与

1. マウスを誘導室に入れ、蓋をしっかりと閉めます。誘導チャンバー内の麻酔の誘導を、500 mL / minの流速で3%イソフルランに設定します。
2. マウスが反応しなくなったら、チャンバーからマウスを取り外し、ノーズコーンをマウスに取り付けます。インターデジタルピンチで麻酔レベルを確認します。濃度を1%〜1.5%のイソフルランに設定し、流速を体重30 gのマウスで100 mL / minに設定します。
3. 麻酔中の乾燥を防ぐために眼科用軟膏を目に塗ります。

3. センサーの準備

1. センサーをセンサー取り付け装置に取り付けて、センサーのテープとカニューレ側を露出させます(図1A)。針がカニューレに挿入されて露出するので注意してください。
2. カニューレの両側のテープに2つの5-0テーパーポイント縫合糸を縫合します(図1A)。

4.脱毛と消毒

1. マウスの背面の正中線の約4 cm x 4 cmの領域を剃ります。
2. 脱毛クリームを剃毛部位に投与して、完全に脱毛します。
3. 皮膚を拭き、2%のグルコン酸クロルヘキシジンと70%のイソプロピルアルコールを含む消毒液を使用して消毒します。

5.背側皮膚の準備

1. 鋭利なハサミを使用して、背骨の上の剃った領域の中央に2mmの切開を行います(図1B)。
2. 簡単に言うと、カニューレを皮下ポケットに簡単に挿入できるように、皮膚の下に鈍いエッジを持つ小さな鉗子を挿入して小さな皮下ポケットを形成します(図1B)。
3. ステップ3.2の縫合糸を切開の両側の皮膚に通します(図1C)。

6.センサーの挿入

1. センサーをセンサー取り付け装置から完全に取り外し(カニューレは針から空になっています)、センサーを鉗子で保持して、周囲のテープがそれ自体に付着しないようにします。
2. カニューレを皮下ポケットに慎重に挿入します。
3. 両側の縫合糸を引っ張り、締めて結んでセンサーをしっかりと固定し、粘着テープが時間の経過とともに緩んだときにカニューレが皮下ポケットから滑り落ちるのを防ぎます。

7.センサーの取り付けと縫合

1. 内側の縫合糸を結び、センサーを囲む粘着テープを使用して、センサーを背面にしっかりと取り付けます。
2. センサーの周りに8つの不連続な縫合糸を作成し、センサーのテープの境界を皮膚に取り付けます(図1D)。

8.リーダーのアクティブ化

1. センサーが挿入されたら、リーダーの電源を入れ、[ 新しいセンサーの開始]を押して、製造元の指示に従ってセンサーをスワイプして、リーダーをアクティブにします。
2. 最初の読み取りは、CGMをインストールしてから数分しか実行できません。このCGMの場合、最初の読み取りは60分後に行うことができます。

9.結果の読み取り

1. リーダーをマウスの近くに置きます(触れる必要はありません)。センサーに保存されているすべてのデータはリーダーに送信されます。
   メモ: CGM デバイスが異なれば、履歴データ保存容量の期間も異なる場合があります。このCGMの場合、2つの読み取り値の間に最大8時間保存できます。

10.センサーの取り外し

1. マウスを麻酔します(セクション2を参照)。
2. 鋭利なハサミを使用して、センサーをマウスの背面に接続する縫合糸を切り取ります。
3. センサーをそっと取り外して、切開部の縫合糸を取り外して切断します。
4. 必要に応じて、単一の縫合糸を使用してマウスの背面の切開を閉じます。

第11章 データ分析

1. データのダウンロード: CGM の製造元の指示に従ってデータをダウンロードします。
   注: 各 CGM には異なる形式があり、ユーザーが簡単にアクセスできる場合とそうでない場合があります。これは、CGMを選択する際の重要な考慮事項です。
2. 付属のソフトウェアで分析するには、Github(https://github.com/mika-littor/CGM-in-Mice-Analysis.git)のreadmeファイルの指示に従ってデータをフォーマットしてください。

図1:センサーのマウスへの取り付け 。 (A)赤い矢印でマークされた2つの縫合糸は、白い矢印でマークされたCGMセンサーの底面にあるカニューレの両側にあるセンサーテープを通過します。(B)鋭利なハサミを使用して、背骨に沿って剃った領域の中央に2mmの小さな切開を行います。鈍い縁を有する小さな鉗子を皮膚の下に短時間挿入して小さな皮下ポケットを形成し、カニューレを皮下に挿入できるようにする。(C) A からの同じ縫合糸を切開の両側で皮下通過させる。赤い矢印は Aのようにセンサーに取り付けられた縫合糸を示し、青い矢印は縫合糸がマウスの後ろの皮膚に通過した場所を示し、黒い矢印は切開を示します。(D)カニューレを挿入した後、内側の縫合糸を締めて切開部の近くに結び、CGMを固定します。次に、センサーを皮膚に縫合します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果

手術転帰
高脂肪高ショ糖食(HFHS)を18週間与えた8匹のHSD:ICRマウス(8週齢)と5匹の痩せたHSD:ICRマウス(12週齢)の結果が示されています。使用したデバイスは、最大8時間データを保存します。地元の動物施設へのアクセスは07:00〜19:00に制限されていたため、マウスが活動している午後遅くのデータ収集は禁止されていました。したがって、マウスは、外科的処置の前に7日間、8時30分...

ディスカッション

このプロトコルは、困難な顕微手術を必要とせず、出血やマウスの取り扱いを伴わない、マウスのグルコースレベルを監視するための簡単で安価な方法を提供します。この方法は、すべての施設で実施するのが簡単で、マウスに死亡率、痛み、または過度の不快感を引き起こすことはありません。プロトコルの最も重要なステップは、グルコースセンサーのカニューレをマウスの皮膚の下に?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2%  Chlorhexidine Gluconate and 70%  Isopropyl Alcohol	3M	ID 7000136290
5% Dextrose and 0.45% Sodium Chloride Injection, USP	Braun	L6120
Castroviejo needle holder	FST	12061-02
Extra Fine Bonn scissors	FST	14084-08
FreeStyle Libre 1 reader	Abbott	ART27543
FreeStyle Libre sensor	Abbott	ART36687
FreeStyle Libre sensor applicator	Abbott	ART36787
Gauze pads	Sion medical	PC912017
Graefe Forceps	FST	11052-10
Hair Removal Cream	Veet	3116523
High-fat high-sucrose diet	Envigo Teklad diets	TD.08811
Isoflurane, USP Terrell	Piramal	26675-46-7
Meloxicam 5 mg/mL	Chanelle Pharma	08749/5024
MiniARCO Clipper kit	Moser	CL8787-KIT
PROLENE Polypropylene Suture 5-0	Ethicon	8725H
Puralube Opthalmic Ointment	Perrigo	574402511
Q-tips	B.H.W	271676
SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System	Kent Scientific	SOMNO