Monitoramento Contínuo Simples de Glicose em Camundongos em Movimento Livre

Resumo

Aqui, descrevemos um método simples para implantar um monitor de glicose contínuo comercial projetado para pacientes em camundongos e fornecemos os scripts para analisar os resultados.

Resumo

Camundongos são um organismo modelo comum usado para estudar doenças metabólicas, como diabetes mellitus. Os níveis de glicose são tipicamente medidos por sangramento de cauda, que requer o manuseio dos camundongos, causa estresse e não fornece dados sobre camundongos que se comportam livremente durante o ciclo escuro. A medição contínua de glicose de última geração em camundongos requer a inserção de uma sonda no arco aórtico do camundongo, bem como um sistema de telemetria especializado. Esse método desafiador e caro não tem sido adotado pela maioria dos laboratórios. Aqui, apresentamos um protocolo simples envolvendo a utilização de monitores contínuos de glicose disponíveis comercialmente usados por milhões de pacientes para medir a glicose continuamente em camundongos como parte da pesquisa básica. A sonda de detecção de glicose é inserida no espaço subcutâneo na parte de trás do mouse através de uma pequena incisão na pele e é mantida firmemente no lugar usando um par de suturas. O dispositivo é suturado à pele do rato para garantir que permanece no lugar. O dispositivo pode medir os níveis de glicose por até 2 semanas e envia os dados para um receptor próximo sem qualquer necessidade de lidar com os ratos. São fornecidos roteiros para a análise dos dados básicos dos níveis glicêmicos registrados. Este método, desde a cirurgia até a análise computacional, é custo-efetivo e potencialmente muito útil na pesquisa metabólica.

Introdução

O diabetes mellitus (DM) é uma doença devastadora caracterizada por níveis elevados de glicose no sangue. O DM tipo 1 pode ser resultado de um ataque autoimune às células beta produtoras de insulina no pâncreas. Já o DM tipo 2 e o DM gestacional são caracterizados pela falha das células beta em secretar insulina suficiente em resposta ao aumento dos níveis glicêmicos¹. O camundongo é um organismo modelo comum usado para estudar o DM, uma vez que tem fisiologia semelhante, e seus níveis normais de glicose são próximos aos dos seres humanos. Além disso, linhagens específicas de camundongos podem desenvolver DM devido a mutações em vias de sinalização chave ou após exposição a dietas específicas, o que permite a modelagem da doença ^2,3,4.

A glicose no sangue é comumente medida em camundongos usando glicosímetros projetados para pacientes extraindo uma pequena gota de sangue (1-2 μL) da ponta da cauda do camundongo. Esse método causa estresse e requer o manuseio do camundongo, o que afeta os níveis de glicose e proíbe a medição dos níveis de glicose no sangue em camundongos de comportamento livre ou quando o pesquisador não está perto de⁵. Sangrar os camundongos pode causar estresse em camundongos próximos, particularmente em camundongos da mesma gaiola cuja glicemia ainda não foi medida, afetando os resultados. Os ratos respondem de forma diferente dependendo do manipulador, e a pessoa que mede a glicose pode afetar os níveis de glicose dos camundongos. Essas armadilhas exigem um planejamento experimental cuidadoso e estão na base de algumas inconsistências entre os experimentos.

É possível medir a glicose em camundongos em movimento livre sem sangramento implantando sensores de glicose no arco aórtico dos camundongos usando telemetria de última geração⁶. As medições resultantes são muito boas e podem ser sustentadas por um longo período, mas é um desafio implantar esses sensores, e o sistema de telemetria é caro, levando a uma adoção moderada dessa metodologia e não adoção em laboratórios não especializados. Sensores de glicose subcutâneos ou outros adaptados às dimensões dos camundongos e sua fisiologia têm sido desenvolvidos nos últimos anos, mas estes novamente requerem especialistas altamente qualificados e, em alguns casos, são dispendiosos 6,7,8,9,10.

Monitores comerciais contínuos de glicose (MCG) que foram originalmente desenvolvidos para monitorar os níveis de glicose de pacientes com DM oferecem outra opção para medir a glicose em camundongos em movimento livre, com menor custo e requisitos de conhecimento técnico do que as sondas implantadas. Tais sondas têm sido utilizadas em pesquisa básica por alguns laboratórios5,11,12,13,14,15, incluindo nossos colegas que utilizaram esse^protocolo16. Esses dispositivos geralmente incluem um sensor, um dispositivo de montagem, um receptor e um aplicativo de software. O sensor tem uma cânula que guia o glicossensor enzimático, fita adesiva, uma fonte de energia, memória de curto prazo e um módulo de comunicação sem fio que armazena e envia os dados para o receptor. O receptor pode mostrar os níveis de glicose atuais e envia os dados para um servidor; Esse receptor pode ser um celular. O aplicativo de software fornece dados para o paciente e a equipe de atendimento médico sobre a glicemia do paciente. Em pacientes, o sensor é acoplado facilmente usando o dispositivo de montagem. A cânula é inserida subcutaneamente pressionando o dispositivo de montagem contra a pele, e o sensor permanece no lugar com a ajuda de fita adesiva.

Este é um protocolo detalhado para adaptar um dispositivo CGM comercial para medir os níveis de glicose em camundongos. Este protocolo descreve como inserir cirurgicamente o sensor de glicose e conectá-lo ao mouse. Scripts para análise básica de dados e visualização de dados são fornecidos. As possíveis armadilhas, solução de problemas e exemplos de resultados padrão são fornecidos. O protocolo abaixo é específico para um determinado CGM, mas pode ser facilmente adaptado a outros tipos de CGMs comerciais à medida que se tornam disponíveis.

Protocolo

Os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Hebraica.

NOTA: Todas as ferramentas devem ser esterilizadas, e o manuseio da cânula deve ser realizado usando uma técnica estéril. O protocolo abaixo é ajustado para uma CGM específica. O protocolo pode ser adaptado para outras CGMs.

1. Administração de analgésicos antes do procedimento

1. Administrar dextrose a 5% e solução salina a 0,45% com meloxicam na dose de 5 mg/kg de peso corporal por via subcutânea.

2. Administração da anestesia

1. Coloque o rato na câmara de indução, fechando bem a tampa. Ajustar a indução anestésica na câmara de indução com isoflurano a 3% a um fluxo de 500 mL/min.
2. Quando o mouse não responder, remova o mouse da câmara e encaixe o cone do nariz no mouse. Confirme o nível de anestesia com uma pinça interdigital. Ajuste a concentração para 1%-1,5% de isoflurano e a taxa de fluxo para 100 mL/min em um camundongo pesando 30 g.
3. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.

3. Preparação do sensor

1. Monte o sensor no dispositivo de montagem do sensor para expor a fita e o lado da cânula do sensor (Figura 1A). Tenha cuidado, pois a agulha é inserida na cânula e exposta.
2. Sutura de dois pontos de conicidade 5-0 na fita em ambos os lados da cânula (Figura 1A).

4. Depilação e desinfecção

1. Faça a barba de aproximadamente 4 cm x 4 cm na linha média da parte de trás do mouse.
2. Administre um creme depilatório na área raspada para garantir a depilação completa.
3. Limpe a pele e desinfete-a com uma solução antisséptica contendo gluconato de clorexidina a 2% e álcool isopropílico a 70%.

5. Preparo da pele dorsal

1. Fazer uma incisão de 2 mm no centro da área raspada acima da coluna vertebral com uma tesoura afiada (Figura 1B).
2. Resumidamente, insira pequenas pinças com uma borda romba sob a pele para formar uma pequena bolsa subcutânea para que a cânula possa ser inserida facilmente na loja subcutânea (Figura 1B).
3. Passar uma sutura do passo 3.2 através da pele de cada lado da incisão (Figura 1C).

6. Inserção do sensor

1. Remova completamente o sensor do dispositivo de montagem do sensor (a cânula está vazia da agulha) e segure o sensor com pinça para evitar que a fita circundante grude em si mesma.
2. Introduza cuidadosamente a cânula na bolsa subcutânea.
3. Puxe as suturas de cada lado, aperte-as e amarre-as para fixar o sensor firmemente no lugar, evitando assim que a cânula escorrege para fora da bolsa subcutânea uma vez que a fita adesiva se solte com o tempo.

7. Fixação e sutura do sensor

1. Fixe o sensor firmemente na parte de trás amarrando as suturas internas e usando a fita adesiva ao redor do sensor.
2. Realizar oito suturas descontínuas ao redor do sensor, fixando a borda da fita métrica do sensor à pele (Figura 1D).

8. Ativação do leitor

1. Depois que o sensor tiver sido inserido, ative o leitor ligando-o, pressionando Start New Sensor e deslizando o sensor de acordo com as instruções do fabricante.
2. A primeira leitura só pode ser feita alguns minutos após a instalação do CGM. No caso desta CGM, a primeira leitura pode ser feita após 60 min.

9. Resultados da leitura

1. Coloque o leitor perto do mouse (não há necessidade de tocá-lo). Todos os dados armazenados no sensor são transmitidos ao leitor.
   Observação : diferentes dispositivos CGM podem diferir no período de capacidade de salvamento de dados históricos. No caso desta CGM, um máximo de 8 h pode ser armazenado entre duas leituras.

10. Removendo o sensor

1. Anestesiar o rato (ver secção 2).
2. Corte as suturas que conectam o sensor à parte de trás do mouse usando uma tesoura afiada.
3. Retire e corte as suturas na incisão, removendo suavemente o sensor.
4. Se necessário, use uma única sutura para fechar a incisão no dorso do mouse.

11. Análise dos dados

1. Download de dados: Faça o download dos dados de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante do CGM.
   Observação : cada CGM tem um formato diferente, que pode ou não ser facilmente acessível para o usuário. Essa é uma consideração importante na escolha do CGM.
2. Para análise com o software fornecido, formate os dados de acordo com as instruções no arquivo readme no Github (https://github.com/mika-littor/CGM-in-Mice-Analysis.git).

Figura 1: Fixação do sensor ao mouse . (A) Duas suturas marcadas por setas vermelhas são passadas através da fita do sensor em ambos os lados da cânula na face inferior do sensor CGM, marcada por uma seta branca. (B) Uma pequena incisão de 2 mm é feita no centro da área raspada ao longo da coluna vertebral usando uma tesoura afiada. Pequenas pinças com borda romba são brevemente inseridas sob a pele para formar uma pequena bolsa subcutânea para que a cânula possa ser inserida por via subcutânea. (C) As mesmas suturas de A são passadas subcutaneamente em cada lado da incisão. As setas vermelhas marcam as suturas fixadas ao sensor como em A, as setas azuis marcam o local pelo qual as suturas passaram até a pele na parte de trás do mouse e a seta preta mostra a incisão. (D) Após a inserção da cânula, as suturas internas são apertadas e amarradas próximas à incisão para fixar a CGM. O sensor é então suturado à pele. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Resultado cirúrgico
Resultados de oito camundongos HSD:ICR (com 8 semanas de idade) alimentados com uma dieta rica em gordura e sacarose (HFHS) por 18 semanas e cinco camundongos HSD:ICR magros (com idade de 12 semanas) são mostrados. O dispositivo que usamos armazena dados por até 8 h. O acesso ao biotério local foi restrito das 07:00 às 19:00, proibindo a coleta de dados durante o horário tardio da noite, quando os camundongos estão ativos. Os camundongos foram, portanto, colocados em uma sal...

Discussão

Este protocolo oferece um método simples e barato para monitorar os níveis de glicose em camundongos que não requer microcirurgia desafiadora e não envolve sangramento ou manuseio dos camundongos. O método é fácil de implementar em todas as instalações e não causa mortalidade, dor ou desconforto excessivo aos camundongos. A etapa mais crítica do protocolo é inserir a cânula do sensor de glicose sob a pele do camundongo. A adição de algumas suturas permite que a cânula permaneça no local por mais tempo. O...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2%  Chlorhexidine Gluconate and 70%  Isopropyl Alcohol	3M	ID 7000136290
5% Dextrose and 0.45% Sodium Chloride Injection, USP	Braun	L6120
Castroviejo needle holder	FST	12061-02
Extra Fine Bonn scissors	FST	14084-08
FreeStyle Libre 1 reader	Abbott	ART27543
FreeStyle Libre sensor	Abbott	ART36687
FreeStyle Libre sensor applicator	Abbott	ART36787
Gauze pads	Sion medical	PC912017
Graefe Forceps	FST	11052-10
Hair Removal Cream	Veet	3116523
High-fat high-sucrose diet	Envigo Teklad diets	TD.08811
Isoflurane, USP Terrell	Piramal	26675-46-7
Meloxicam 5 mg/mL	Chanelle Pharma	08749/5024
MiniARCO Clipper kit	Moser	CL8787-KIT
PROLENE Polypropylene Suture 5-0	Ethicon	8725H
Puralube Opthalmic Ointment	Perrigo	574402511
Q-tips	B.H.W	271676
SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System	Kent Scientific	SOMNO