JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوضح البروتوكول المقدم هنا تخليق جيلاتين هيدروجيل لاصق قوي o-nitrosobenzaldehyde (الجيلاتين-NB). يتمتع Gelatin-NB بقدرة سريعة وفعالة على التصاق الأنسجة ، والتي يمكن أن تشكل حاجزا ماديا قويا لحماية أسطح الجروح ، لذلك من المتوقع أن يتم تطبيقه في مجال التكنولوجيا الحيوية لإصلاح الإصابات.

Abstract

أصبحت المواد اللاصقة مواد حيوية شائعة في مجال الهندسة الطبية الحيوية والأنسجة. في عملنا السابق ، قدمنا مادة جديدة - الجيلاتين o-nitrosobenzaldehyde (الجيلاتين-NB) - والتي تستخدم أساسا لتجديد الأنسجة وتم التحقق من صحتها في النماذج الحيوانية لإصابة القرنية ومرض التهاب الأمعاء. هذا هيدروجيل جديد يتكون عن طريق تعديل الجيلاتين البيولوجي مع o-nitrosobenzaldehyde (NB). تم تصنيع الجيلاتين-NB عن طريق تنشيط مجموعة الكربوكسيل من NB-COOH والتفاعل مع الجيلاتين من خلال 1- (3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) -3-إيثيل كاربوديميد هيدروكلوريد (EDC) و N-hydroxysuccinimide (NHS). تم تنقية المركب الذي تم الحصول عليه لتوليد المنتج النهائي ، والذي يمكن تخزينه بثبات لمدة 18 شهرا على الأقل. NB لديه التصاق قوي ب -NH2 على الأنسجة ، والتي يمكن أن تشكل العديد من روابط C = N ، وبالتالي زيادة التصاق الجيلاتين-NB بواجهة الأنسجة. تتضمن عملية التحضير خطوات لتوليف مجموعة NB-COOH ، وتعديل المجموعة ، وتوليف الجيلاتين-NB ، وتنقية المركب. الهدف هو وصف عملية التوليف المحددة للجيلاتين-NB بالتفصيل وإظهار تطبيق الجيلاتين-NB لإصلاح الضرر. علاوة على ذلك ، يتم تقديم البروتوكول لزيادة تعزيز وتوسيع طبيعة المواد التي ينتجها المجتمع العلمي لسيناريوهات أكثر قابلية للتطبيق.

Introduction

هيدروجيل هو نوع من البوليمر ثلاثي الأبعاد يتكون من تورم الماء. على وجه الخصوص ، يستخدم الهيدروجيل المشتق من مصفوفة خارج الخلية على نطاق واسع في مجال التخليق الحيوي والطب التجديدي بسبب توافقه الحيوي الممتاز وفعاليته العلاجية1. تم الإبلاغ عن الهلاميات المائية لعلاج قرحة المعدة والتهاب الأعصاب واحتشاء عضلة القلب2،3،4 وأمراض أخرى. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن الجيلاتين-NB يمكن أن يعزز نتائج التهاب الأمعاء غير الالتهابي (IBD)5. تشمل الهلاميات المائية التقليدية صمغ جيلان ، جيلاتين ، حمض الهيالورونيك ، بولي إيثيلين جلايكول (PEG) ، طبقات ، كارهة للماء / محبة للماء ، ألجينات / بولي أكريلاميد ، شبكة مزدوجة ، وهلاميات مائية متعددة المذبذبات6 ، وكلها لها توافق نسيجي جيد وخصائص ميكانيكية. ومع ذلك ، فإن هذه الهلاميات المائية التقليدية عرضة للرطوبة والهواء في البيئة. إذا تعرضوا للهواء لفترة طويلة ، فسوف يفقدون الماء ويجفون ؛ إذا تم غمرها في الماء لفترة طويلة ، فسوف تمتص الماء وتتوسع7 ، مما يقلل من مرونتها ووظيفتها الميكانيكية. بالإضافة إلى ذلك ، يعد الحفاظ على التصاق أنسجة الهلاميات المائية التقليدية تحديا كبيرا8.

بناء على ذلك ، قمنا بتصميم وتوليف جيلاتين هيدروجيل نانوي ، وهو هيدروجيل جديد يتكون عن طريق تعديل الجيلاتين البيولوجي باستخدام NB (الشكل 1). NB لديه قدرة التصاق قوية ل -NH2 على الأنسجة ، والتي يمكن أن تشكل عددا كبيرا من الروابط C = N ، وبالتالي زيادة التصاق واجهة الأنسجة المائية. هذا الالتصاق القوي يمكن أن يجعل الهيدروجيل يلتصق بقوة بسطح الأنسجة ، وبالتالي يشكل طبقة جزيئية على مستوى النانو. في الدراسات السابقة للفريق ، تم التأكيد على أن هذا النوع من طلاء الهيدروجيل المعدل قد حسن التصاق الأنسجة9. يمكن أن تلتصق بثبات بأعضاء وأنسجة القرنية والأمعاء وتلعب أدوارا مضادة للالتهابات وعزل الحاجز وتعزيز التجديد. الهدف هو تقديم عملية التوليف المحددة للجيلاتين-NB بالتفصيل هنا ، بحيث يمكن تطبيق الجيلاتين-NB في المزيد من سيناريوهات إصلاح الضرر. علاوة على ذلك ، نشجع الباحثين الآخرين على زيادة تعزيز وتوسيع طبيعة هذه المادة لتناسب المزيد من سيناريوهات التطبيق.

Protocol

تم شراء الفئران C57BL / 6 من كلية الطب بجامعة تشجيانغ مستشفى السير ران ران شو. تم شراء الأرانب النيوزيلندية من جامعة تشجيانغ. تم الحفاظ على الحيوانات في ظروف دورة الضوء والظلام الطبيعية وأعطيت الطعام ومياه الشرب بحرية. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية أخلاقيا من خلال المبادئ التوجيهية المؤسسية للمبادئ التوجيهية القياسية للجنة أخلاقيات جامعة تشجيانغ (ZJU20200156) وكلية الطب بجامعة تشجيانغ السير ران ران شو مستشفى رعاية واستخدام الحيوان ، والتي تتوافق مع دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر (SRRSH202107106).

1. توليف NB-COOH

  1. تحضير 4-هيدروكسي-3- (ميثوكسي-D3) بنزالديهايد (8.90 جم ، 58.5 مللي مول ، مكافئات 1.06 [مكافئ]) ، كربونات البوتاسيوم (10.2 جم ، 73.8 مللي مول ، 1.34 مكافئ) ، وميثيل 4-بروموبوتيرات (9.89 جم ، 55.0 مللي مول ، 1.0 مكافئ) بناء على البروتوكول المقترح في الدراسة السابقة10. تذوب المركبات في 40 مل من N، N-dimethylformamide (DMF) ويقلب في درجة الحرارة المحيطة لمدة 16 ساعة.
  2. أضف 200 مل من الماء 0 درجة مئوية إلى الخليط وترسيب الخليط للحصول على منتج خام.
  3. قم بإذابة المنتج الخام بشكل متكرر في DMF ثم ترسب لمدة خمس دورات. ترسب المنتج الخام وجففه عند 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة للحصول على المنتج المبكر.

2. التعديل الكيميائي والمعالجة

  1. قم بإجراء استبدال ipso لميثيل 4- (4-فورميل-2-ميثوكسي فينوكسي ميثوكسي فينيل) حمض البيوتانويك ميثيل استر كما هو موضح أدناه.
  2. أضف 9.4 جم من ميثيل 4- (4-فورميل-2-ميثوكسي فينوكسي) بيوتانوات (37.3 مللي مول ، 1 مكافئ) ببطء إلى محلول مبرد مسبقا (-2 درجة مئوية) من حمض النيتريك 70٪ (140 مل) وحرك عند -2 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
    ملاحظة: اعتمادا على درجة حرارة تفاعل النترات ، سيحدث استبدال ipso ل formyl.
  3. قم بتصفية الخليط (~ 9.0 جم) ب 200 مل من الماء 0 درجة مئوية ، ثم قم بتنقيته في DMF لترسيب منتج صلب.
  4. تحلل المنتج الصلب في حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) / H2O ، 1:10 فولت / فولت (100 مل) عند 90 درجة مئوية وجاف. قم بإزالة المذيب الذي يقل عن 80 كيلو باسكال للحصول على المنتج الوسيط النهائي ، وهو مسحوق جاف أصفر باهت.
  5. قم بإذابة المنتج الوسيط (7.4 جم ، 23.8 مللي مول ، 1.0 مكافئ) في رباعي هيدروفوران (THF) / إيثانول ، 1: 1 فولت / فولت (100 مل). ثم أضف 1.43 جم من NaBH4 (35.7 مللي مول ، 1.5 مكافئ) ببطء عند 0 درجة مئوية. بعد 3 ساعات ، قم بإزالة جميع المذيبات تحت فراغ وتعليق البقايا في محلول 1: 1 من الماء وثنائي كلورو الميثان (50 مل لكل منهما).
  6. تحضير ثنائي كلورو الميثان لاستخراج المنتج من الطبقة المائية. قم بإزالة الطبقة العضوية وجففها فوق كبريتات المغنيسيوم.
  7. تنقية المنتج الخام عن طريق كروماتوغرافيا عمود هلام السيليكا باستخدام DCM / MeOH بنسبة 10: 1 (1٪ TEA). أخيرا ، احصل على 5.31 جم (18.6 مللي مول ، 78.3٪) من مسحوق مصفر نقي نسبيا NB-COOH.

3. تخليق الجيلاتين- NB

  1. تحضير 5 غرام من الجيلاتين لدفعة واحدة من التعديل. تحضير محلول جيلاتيني متجانس عن طريق إذابة 5 جم من الجيلاتين في 100 مل من الماء منزوع الأيونات وتخزينه عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: هنا ، يتم تعريف 33 × 10-5 مولات أصلية ε مجموعات أمينية / جم جيلاتين11 .
  2. حدد نسبة التغذية (FR) على أنها النسبة المولية بين مجموعات NB والمجموعات الأمينية الأولية في الجيلاتين. في هذه الدراسة ، تم تعريف 53 ملغ من NB مع 1 غرام من الجيلاتين على أنه FRNB = 1.
  3. قم بإذابة 1060 مجم من NB-COOH في 5 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لتنشيط مجموعات الكربوكسيل من NB-COOH. نظرا لأن مجموعة NB حساسة للأشعة فوق البنفسجية (UV) عندما تكون في المحلول ، فاحفظها دائما بعيدا عن الضوء.
  4. أضف 746 مجم من 1- (3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) -3-إيثيل كاربوديميد هيدروكلوريد (EDC) في محلول NB-COOH DMSO وحركه لمدة 5 دقائق. بعد إذابة EDC ، أضف 448 مجم من N-hydroxysuccinimide (NHS) وحرك لمدة 5 دقائق.
  5. استخدم قمع إسقاط لإسقاط الخليط ببطء بمعدل 0.5 مل / دقيقة في محلول الجيلاتين المذاب مع التقليب القوي للتفاعل عند 45 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.

4. تنقية وتخزين المنتج

  1. قم بغسيل محلول الجيلاتين-NB ضد الماء الزائد منزوع الأيونات لمدة 3 أيام على الأقل ، ثم قم بجمعه وتجميده وتجفيفه بالتجميد للحصول على رغاوي الجيلاتين-NB. احتفظ بالرغاوي في مجفف في الظلام لاستخدامها مرة أخرى.
  2. قم بإذابة رغاوي الجيلاتين-NB المجففة بالتجميد في ماء منزوع الأيونات عند 37 درجة مئوية ، مباشرة قبل الاستخدام.

النتائج

يوضح الشكل 2 أ مخططا للتفاعلات الكيميائية الرئيسية التي ينطوي عليها تخليق الجيلاتين-NB ، والذي يعزز تكامل الأنسجة عن طريق تطعيم مجموعات NB على الجيلاتين. يوضح الشكل 2B أن O-nitrobenzene الخاص بهيدروجيل الجيلاتين-NB يتحول إلى مجموعة NB مباشرة بعد تشعيع الأشعة فوق البنف...

Discussion

المواد اللاصقة هي فئة جديدة من المواد. يلتزم المزيد والمزيد من الباحثين بتوليف أنواع مختلفة من المواد اللاصقة ، ويحاولون العثور على تطبيقاتهم في التكنولوجيا الحيوية وهندسة الأنسجة والطب التجديدي وغيرها من المجالات ، مما أدى إلى تطور قوي في السنوات الأخيرة. بالإضافة إلى التركيز على الالت...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

اي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC)AladdinL287553
4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehydeShanghai Acmec Biochemical Co., LtdH946072
DCMAladdinD154840
DichloromethaneSigma-Aldrich270997
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich20-139
dimethylformamide (DMF)Sigma-AldrichPHR1553
gelatinSigma-Aldrich1288485
magnesium sulfateSigma-AldrichM7506
MeOHSigma-Aldrich1424109
methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl esterchemsrc141333-27-9
methyl 4-bromobutyrateAladdinM158832
NaBH4Sigma-Aldrich215511
N-hydroxysuccinimide (NHS)AladdinD342712
nitric acidSigma-Aldrich225711
potassium carbonateSigma-Aldrich209619
SEM (Nova Nano 450)Thermo FEI17024560
THF/EtOHAladdinD380010
trifluoroacetic acid (TFA)Sigma-Aldrich8.0826

References

  1. Tam, R. Y., Smith, L. J., Shoichet, M. S. Engineering cellular microenvironments with photo- and enzymatically responsive hydrogels: toward biomimetic 3D cell culture models. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 703-713 (2017).
  2. Xu, X., et al. Bioadhesive hydrogels demonstrating pH-independent and ultrafast gelation promote gastric ulcer healing in pigs. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
  3. Zheng, J., et al. Directed self-assembly of herbal small molecules into sustained release hydrogels for treating neural inflammation. Nature Communications. 10 (1), 1604 (2019).
  4. Seif-Naraghi, S. B., et al. Safety and efficacy of an injectable extracellular matrix hydrogel for treating myocardial infarction. Science Translational Medicine. 5 (173), (2013).
  5. Mao, Q., et al. GelNB molecular coating as a biophysical barrier to isolate intestinal irritating metabolites and regulate intestinal microbial homeostasis in the treatment of inflammatory bowel disease. Bioactive Materials. 19, 251-267 (2022).
  6. Nan, J., et al. A highly elastic and fatigue-resistant natural protein-reinforced hydrogel electrolyte for reversible-compressible quasi-solid-state supercapacitors. Advanced Science. 7 (14), 2000587 (2020).
  7. Matsumoto, K., Sakikawa, N., Miyata, T. Thermo-responsive gels that absorb moisture and ooze water. Nature Communications. 9 (1), 2315 (2018).
  8. Liu, R., et al. resilient, adhesive, and anti-freezing hydrogels cross-linked with a macromolecular cross-linker for wearable strain sensors. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (35), 42052-42062 (2021).
  9. Hong, Y., et al. A strongly adhesive hemostatic hydrogel for the repair of arterial and heart bleeds. Nature Communications. 10 (1), 2060 (2019).
  10. Yang, Y., et al. Tissue-integratable and biocompatible photogelation by the imine crosslinking reaction. Advanced Materials. 28 (14), 2724-2730 (2016).
  11. Ofner, C. M., Bubnis, W. A. Chemical and swelling evaluations of amino group crosslinking in gelatin and modified gelatin matrices. Pharmaceutical Research. 13 (12), 1821-1827 (1996).
  12. Zhang, Y., et al. A long-term retaining molecular coating for corneal regeneration. Bioactive Materials. 6 (12), 4447-4454 (2021).
  13. Liang, Y., Li, Z., Huang, Y., Yu, R., Guo, B. Dual-dynamic-bond cross-linked antibacterial adhesive hydrogel sealants with on-demand removability for post-wound-closure and infected wound healing. ACS Nano. 15 (4), 7078-7093 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

189 o nitrosobenzaldehyde

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved