Синтез сильного адгезивного гидрогеля, желатина О-нитрозобензальдегида

Резюме

Представленный здесь протокол показывает синтез прочного адгезивного гидрогеля желатина о-нитрозобензальдегида (желатин-NB). Желатин-NB обладает быстрой и эффективной адгезионной способностью к тканям, которая может образовывать прочный физический барьер для защиты раневых поверхностей, поэтому ожидается, что он будет применяться в области биотехнологии восстановления травм.

Аннотация

Адгезивные материалы стали популярными биоматериалами в области биомедицины и тканевой инженерии. В нашей предыдущей работе мы представили новый материал - желатин о-нитрозобензальдегид (желатин-NB) - который в основном используется для регенерации тканей и был проверен на животных моделях повреждения роговицы и воспалительных заболеваний кишечника. Это новый гидрогель, образованный путем модификации биологического желатина о-нитрозобензальдегидом (NB). Желатин-NB был синтезирован путем активации карбоксильной группы NB-COOH и реакции с желатином через гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимид (NHS). Полученное соединение очищали для получения конечного продукта, который может стабильно храниться не менее 18 месяцев. NB имеет сильную адгезию к -_NH2 на ткани, которая может образовывать множество связей C = N, тем самым увеличивая адгезию желатина-NB к тканевому интерфейсу. Процесс получения включает этапы синтеза группы NB-COOH, модификацию группы, синтез желатина-NB и очистку соединения. Цель состоит в том, чтобы подробно описать специфический процесс синтеза желатина-NB и продемонстрировать применение желатина-NB для восстановления повреждений. Кроме того, протокол представлен для дальнейшего укрепления и расширения характера материала, подготовленного научным сообществом, для более применимых сценариев.

Введение

Гидрогель представляет собой тип трехмерного полимера, образованного набуханием воды. В частности, гидрогель, полученный из внеклеточного матрикса, широко используется в области биосинтеза и регенеративной медицины из-за его превосходной биосовместимости и терапевтической^{эффективности1}. Сообщалось, что гидрогели используются для лечения язвы желудка, невритов, инфаркта миокарда ^2,3,4 и других заболеваний. Кроме того, было доказано, что желатин-NB может способствовать исходу воспалительного заболевания кишечника (ВЗК)⁵. Традиционные гидрогели включают геллановую камедь, желатин, гиалуроновую кислоту, полиэтиленгликоль (ПЭГ), слоистые, гидрофобные/гидрофильные, альгинатные/полиакриламидные, двухсетчатые и полиамфотерные гидрогели⁶, все из которых обладают хорошей гистосовместимостью и механическими свойствами. Однако эти традиционные гидрогели уязвимы к влаге и воздуху в окружающей среде. Если они будут подвергаться воздействию воздуха в течение длительного времени, они потеряют воду и высохнут; Если они погружены в воду на длительное время, они будут поглощать воду и расширяться⁷, тем самым уменьшая их гибкость и механическую функцию. Кроме того, поддержание тканевой адгезии обычных гидрогелей является серьезной проблемой⁸.

Исходя из этого, мы разработали и синтезировали наноразмерный гидрогель-желатин-NB, который представляет собой новый гидрогель, образованный путем модификации биологического желатина NB (рис. 1). NB обладает сильной адгезионной способностью к -_NH2 на ткани, что может образовывать большое количество связей C = N, тем самым увеличивая адгезивность границы раздела гидрогель-ткань. Эта сильная адгезия может заставить гидрогель прочно прилипать к поверхности ткани, образуя таким образом молекулярное покрытие наноуровня. В предыдущих исследованиях команды было подтверждено, что этот вид модифицированного гидрогелевого покрытия улучшает адгезию тканей⁹; Он может стабильно прилипать к органам и тканям роговицы и кишечника и играть роль в противовоспалительной, барьерной изоляции и стимулировании регенерации. Цель состоит в том, чтобы подробно представить здесь специфический процесс синтеза желатина-NB, чтобы желатин-NB можно было применять в большем количестве сценариев восстановления повреждений. Кроме того, мы призываем других исследователей еще больше укрепить и расширить природу этого материала, чтобы он соответствовал большему количеству сценариев применения.

протокол

Мыши C57BL / 6 были приобретены в больнице сэра Ран Шоу Медицинской школы Чжэцзянского университета. Новозеландские кролики были приобретены в Чжэцзянском университете. Животные содержались в естественных условиях цикла света и темноты, им бесплатно давали пищу и питьевую воду. Все экспериментальные процедуры были этически одобрены институциональными руководящими принципами стандартных руководящих принципов Комитета по этике Чжэцзянского университета (ZJU20200156) и Комитета по уходу за животными и использованию в больнице Сэр Ран Ран Шоу Медицинской школы Чжэцзянского университета, которые соответствовали Руководству NIH по уходу за лабораторными животными и их использованию (SRRSH202107106).

1. Синтез NB-COOH

1. Приготовьте 4-гидрокси-3-(метокси-D3)бензальдегид (8,90 г, 58,5 мМ, 1,06 эквивалента [экв.]), карбонат калия (10,2 г, 73,8 мМ, 1,34 экв.) и метил-4-бромбутират (9,89 г, 55,0 мМ, 1,0 экв.) на основе протокола, предложенного в предыдущем исследовании¹⁰. Растворяют соединения в 40 мл N, N-диметилформамида (ДМФ) и перемешивают при температуре окружающей среды в течение 16 ч.
2. Добавьте в смесь 200 мл воды с температурой 0 °C и осаждайте смесь до получения сырого продукта.
3. Многократно растворяют сырой продукт в ДМФ, а затем осаждают в течение пяти циклов. Осаждайте сырой продукт и сушите его при 80 °C в течение 2 часов, чтобы получить ранний продукт.

2. Химическая модификация и переработка

1. Выполните ipso-замену метилового эфира 4-(4-формил-2-метоксифеноксиметоксифенил)бутановой кислоты, как описано ниже.
2. Медленно добавить 9,4 г метил-4-(4-формил-2-метоксифенокси)бутаноата (37,3 мМ, 1 экв.) в предварительно охлажденный (-2 °C) раствор 70% азотной кислоты (140 мл) и перемешивать при -2 °C в течение 3 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от температуры реакции нитрования будет происходить ipsoзамещение формильного фрагмента.
3. Отфильтруйте смесь (~ 9,0 г) 200 мл воды с температурой 0 °C, затем очистите ее в ДМФА для осаждения твердого продукта.
4. Гидролизуют твердый продукт в трифторуксусной кислоте (TFA)/H₂O, 1:10 об./об. (100 мл) при 90 °C и высушивают. Удалите растворитель под давлением 80 кПа, чтобы получить конечный промежуточный продукт, сухой бледно-желтый порошок.
5. Растворяют промежуточный продукт (7,4 г, 23,8 мМ, 1,0 экв.) в тетрагидрофуране (ТГФ)/этаноле в дозе 1:1 об./об. (100 мл). Затем медленно добавляют 1,43 г NaBH₄ (35,7 мМ, 1,5 экв.) при 0 °C. Через 3 ч удалите все растворители под вакуумом и суспендируйте остаток в воде 1:1 и растворе дихлорметана (по 50 мл каждый).
6. Подготовьте дихлорметан для извлечения продукта из водного слоя. Удалите органический слой и просушите над сульфатом магния.
7. Очистите сырой продукт с помощью колоночной хроматографии силикагеля с использованием DCM/MeOH в соотношении 10:1 (1% TEA). Наконец, получают 5,31 г (18,6 мМ, 78,3%) относительно чистого желтоватого порошка NB-COOH.

3. Синтез желатина-NB

1. Приготовьте 5 г желатина для одной партии модификации. Приготовьте однородный раствор желатина, растворив 5 г желатина в 100 мл деионизированной воды, и храните при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь определяется исходное значение 33 x 10-5 моль ^{ε-аминогрупп} / г желатина¹¹ .
2. Определите коэффициент подачи (FR) как молярное отношение между группами NB и первичными аминогруппами в желатине. В этом исследовании 53 мг NB с 1 г желатина были определены как FR_NB = 1.
3. Растворите 1,060 мг NB-COOH в 5 мл диметилсульфоксида (ДМСО) для активации карбоксильных групп NB-COOH. Поскольку группа NB чувствительна к ультрафиолетовому (УФ) излучению в растворе, всегда держите ее подальше от света.
4. Добавьте 746 мг 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодимида гидрохлорида (EDC) в раствор NB-COOH DMSO и перемешивайте в течение 5 мин. После растворения EDC добавьте 448 мг N-гидроксисукцинимида (NHS) и перемешивайте в течение 5 минут.
5. С помощью капельной воронки медленно опускайте смесь со скоростью 0,5 мл/мин в растворенный раствор желатина при интенсивном перемешивании до реакции при 45 °C в течение 4 часов.

4. Очистка и хранение продукта

1. Диализируйте раствор желатина-NB от избытка деионизированной воды в течение не менее 3 дней, затем соберите, заморозьте и лиофилизируйте его, чтобы получить пену желатина-NB. Храните пену в эксикаторе в темноте для дальнейшего использования.
2. Лиофилизированные пенопласты желатина-NB растворяют в деионизированной воде при температуре 37 °C непосредственно перед использованием.

Результаты

На рисунке 2А показана схема основных химических реакций, участвующих в синтезе желатина-NB, который способствует тканевой интеграции путем прививки групп NB к желатину. На рисунке 2B показано, что O-нитробензол желатина-NB-гидрогеля превращается в группу NB ?...

Обсуждение

Адгезивные материалы – это новый класс материалов. Все больше и больше исследователей стремятся к синтезу различных типов адгезивных материалов и пытаются найти их применение в биотехнологии, тканевой инженерии, регенеративной медицине и других областях, что привело к активному разв...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC)	Aladdin	L287553
4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde	Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd	H946072
DCM	Aladdin	D154840
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	20-139
dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	PHR1553
gelatin	Sigma-Aldrich	1288485
magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
MeOH	Sigma-Aldrich	1424109
methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester	chemsrc	141333-27-9
methyl 4-bromobutyrate	Aladdin	M158832
NaBH4	Sigma-Aldrich	215511
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Aladdin	D342712
nitric acid	Sigma-Aldrich	225711
potassium carbonate	Sigma-Aldrich	209619
SEM (Nova Nano 450)	Thermo FEI	17024560
THF/EtOH	Aladdin	D380010
trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma-Aldrich	8.0826