Synthèse d’hydrogel adhésif fort, de gélatine O-nitrosobenzaldéhyde

Résumé

Le protocole présenté ici montre la synthèse d’un hydrogel adhésif fort gélatine o-nitrosobenzaldéhyde (gélatine-NB). La gélatine-NB a une capacité d’adhérence tissulaire rapide et efficace, qui peut former une barrière physique solide pour protéger les surfaces des plaies, de sorte qu’elle devrait être appliquée au domaine de la biotechnologie de réparation des blessures.

Résumé

Les matériaux adhésifs sont devenus des biomatériaux populaires dans le domaine de l’ingénierie biomédicale et tissulaire. Dans nos travaux précédents, nous avons présenté un nouveau matériau - la gélatine o-nitrosobenzaldéhyde (gélatine-NB) - qui est principalement utilisé pour la régénération tissulaire et a été validé dans des modèles animaux de lésions cornéennes et de maladies inflammatoires de l’intestin. Il s’agit d’un nouvel hydrogel formé par modification de la gélatine biologique avec de l’o-nitrosobenzaldéhyde (NB). La gélatine-NB a été synthétisée en activant le groupe carboxyle du NB-COOH et en réagissant avec la gélatine par l’intermédiaire du chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide (EDC) et du N-hydroxysuccinimide (NHS). Le composé obtenu a été purifié pour générer le produit final, qui peut être stocké de manière stable pendant au moins 18 mois. NB a une forte adhérence à -_NH2 sur le tissu, ce qui peut former de nombreuses liaisons C = N, augmentant ainsi l’adhésion de la gélatine-NB à l’interface tissulaire. Le processus de préparation comprend des étapes pour la synthèse du groupe NB-COOH, la modification du groupe, la synthèse de la gélatine-NB et la purification du composé. L’objectif est de décrire en détail le processus de synthèse spécifique de la gélatine-NB et de démontrer l’application de la gélatine-NB à la réparation des dommages. En outre, le protocole est présenté pour renforcer et élargir davantage la nature du matériel produit par la communauté scientifique pour des scénarios plus applicables.

Introduction

L’hydrogel est un type de polymère tridimensionnel formé par gonflement de l’eau. En particulier, l’hydrogel dérivé d’une matrice extracellulaire est largement utilisé dans le domaine de la biosynthèse et de la médecine régénérative en raison de son excellente biocompatibilité et de son efficacité thérapeutique¹. Des hydrogels ont été rapportés pour le traitement des ulcères gastriques, des névrites, de l’infarctus du myocarde ^2,3,4 et d’autres maladies. De plus, il a été prouvé que la gélatine-NB peut favoriser l’issue de l’inflammation de la maladie inflammatoire de l’intestin (MII)⁵. Les hydrogels traditionnels comprennent la gomme gellane, la gélatine, l’acide hyaluronique, le polyéthylèneglycol (PEG), les hydrophobes/hydrophiles, les hydrophobes/hydrophiles, l’alginate/polyacrylamide, le double réseau et les hydrogels^{polyamphotères 6}, qui ont tous de bonnes propriétés histocompatibles et mécaniques. Cependant, ces hydrogels traditionnels sont vulnérables à l’humidité et à l’air présents dans l’environnement. S’ils sont exposés à l’air pendant une longue période, ils perdront de l’eau et sècheront; S’ils sont immergés dans l’eau pendant une longue période, ils absorberont l’eau et se dilateront⁷, réduisant ainsi leur flexibilité et leur fonction mécanique. De plus, le maintien de l’adhérence tissulaire des hydrogels conventionnels est un défi majeur⁸.

Sur cette base, nous avons conçu et synthétisé un hydrogel à l’échelle nanométrique gélatine-NB, qui est un nouvel hydrogel formé en modifiant la gélatine biologique avec NB (Figure 1). NB a une forte capacité d’adhérence à -_NH2 sur le tissu, ce qui peut former un grand nombre de liaisons C = N, augmentant ainsi l’adhérence de l’interface hydrogel-tissu. Cette forte adhérence peut faire adhérer fermement l’hydrogel à la surface du tissu, formant ainsi un revêtement moléculaire de niveau nanométrique. Dans les études précédentes de l’équipe, il a été confirmé que ce type de revêtement hydrogel modifié a amélioré l’adhérence tissulaire⁹; Il peut adhérer de manière stable aux organes et tissus cornéens et intestinaux et jouer un rôle anti-inflammatoire, d’isolation de barrière et de promotion de la régénération. L’objectif est d’introduire ici en détail le processus de synthèse spécifique de la gélatine-NB, afin que la gélatine-NB puisse être appliquée dans plus de scénarios de réparation des dommages. De plus, nous encourageons d’autres chercheurs à renforcer et à élargir la nature de ce matériau pour l’adapter à davantage de scénarios d’application.

Protocole

Les souris C57BL / 6 ont été achetées à l’école de médecine Sir Run Run Shaw de l’Université du Zhejiang. Les lapins néo-zélandais ont été achetés à l’Université du Zhejiang. Les animaux ont été maintenus dans des conditions naturelles de cycle lumière-obscurité et ont reçu de la nourriture et de l’eau potable librement. Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées de manière éthique par les directives institutionnelles des directives standard du comité d’éthique de l’Université du Zhejiang (ZJU20200156) et du comité de soin et d’utilisation des animaux de l’école de médecine de l’Université du Zhejiang Sir Run Run Shaw, qui se conformait au guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (SRRSH202107106).

1. Synthèse du NB-COOH

1. Préparer le 4-hydroxy-3-(méthoxy-D3) benzaldéhyde (8,90 g, 58,5 mM, 1,06 équivalents [eq.]), le carbonate de potassium (10,2 g, 73,8 mM, 1,34 eq.) et le 4-bromobutyrate de méthyle (9,89 g, 55,0 mM, 1,0 eq.) en fonction du protocole proposé dans l’étude précédente¹⁰. Dissoudre les composés dans 40 mL de N,N-diméthylformamide (DMF) et agiter à température ambiante pendant 16 h.
2. Ajouter 200 mL d’eau à 0 °C au mélange et précipiter le mélange pour obtenir un produit brut.
3. Dissoudre à plusieurs reprises le produit brut dans du DMF, puis précipiter pendant cinq cycles. Précipiter le produit brut et le sécher à 80 °C pendant 2 h pour obtenir le produit primeur.

2. Modification et traitement chimiques

1. Effectuer la substitution ipso de l’ester méthylique de l’acide 4-(4-formyl-2-méthoxyphénoxyméthoxyphényl)butanoïque comme décrit ci-dessous.
2. Ajouter lentement 9,4 g de butanoate de 4-(4-formyl-2-méthoxyphénoxy) de méthyle (37,3 mM, 1 éq.) à une solution prérefroidie (-2 °C) d’acide nitrique à 70 % (140 mL) et agiter à -2 °C pendant 3 h.
   REMARQUE: En fonction de la température de la réaction de nitration, la substitution ipso de la fraction formyle se produira.
3. Filtrer le mélange (~9,0 g) avec 200 mL d’eau à 0 °C, puis le purifier dans du FMM pour précipiter un produit solide.
4. Hydrolyser le produit solide dans de l’acide trifluoroacétique (TFA)/H₂O, 1:10 v/v (100 mL) à 90 °C et sécher. Retirer le solvant sous 80 kPa pour obtenir le produit intermédiaire final, une poudre sèche jaune pâle.
5. Dissoudre le produit intermédiaire (7,4 g, 23,8 mM, 1,0 éq.) dans le tétrahydrofurane (THF)/éthanol, 1:1 v/v (100 mL). Ajouter ensuite 1,43 g de_NaBH4 (35,7 mM, 1,5 eq.) lentement à 0 °C. Après 3 h, retirer tous les solvants sous vide et suspendre le résidu dans une solution d’eau et de dichlorométhane 1:1 (50 mL chacune).
6. Préparer le dichlorométhane pour extraire le produit de la couche aqueuse. Retirer la couche organique et sécher sur le sulfate de magnésium.
7. Purifier le produit brut par chromatographie sur colonne de gel de silice en utilisant DCM/MeOH à un rapport de 10:1 (1% TEA). Enfin, obtenir 5,31 g (18,6 mM, 78,3%) de poudre jaunâtre relativement pure NB-COOH.

3. Synthèse de gélatine-NB

1. Préparer 5 g de gélatine pour un lot de modification. Préparer une solution homogène de gélatine en dissolvant 5 g de gélatine dans 100 mL d’eau désionisée et conserver à 37 °C.
   REMARQUE: Ici, les 33 x 10-5 moles d’origine ^ε-groupes aminés / g gélatine¹¹ sont définies.
2. Définir le rapport alimentaire (FR) comme le rapport molaire entre les groupes NB et les groupes aminés primaires dans la gélatine. Dans cette étude, 53 mg de NB avec 1 g de gélatine ont été définis comme FR_NB = 1.
3. Dissoudre 1 060 mg de NB-COOH dans 5 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour activer les groupes carboxyle du NB-COOH. Étant donné que le groupe NB est sensible à la lumière ultraviolette (UV) lorsqu’il est en solution, gardez-le toujours à l’écart de la lumière.
4. Ajouter 746 mg de chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodimide (EDC) dans la solution de NB-COOH DMSO et agiter pendant 5 min. Après dissolution de l’EDC, ajouter 448 mg de N-hydroxysuccinimide (NHS) et agiter pendant 5 minutes.
5. Utiliser un entonnoir à goutte pour déposer lentement le mélange à un débit de 0,5 mL/min dans la solution de gélatine dissoute en agitant vigoureusement pour réagir à 45 °C pendant 4 h.

4. Purification et stockage du produit

1. Dialyser la solution gélatine-NB contre l’excès d’eau désionisée pendant au moins 3 jours, puis recueillir, congeler et lyophiliser pour obtenir les mousses gélatine-NB. Gardez les mousses dans un dessiccateur dans l’obscurité pour une utilisation ultérieure.
2. Dissoudre les mousses de gélatine lyophilisée-NB dans de l’eau désionisée à 37 °C, immédiatement avant utilisation.

Résultats

La figure 2A montre un schéma des principales réactions chimiques impliquées dans la synthèse de la gélatine-NB, ce qui favorise l’intégration tissulaire en greffant des groupes NB sur de la gélatine. La figure 2B montre que l’O-nitrobenzène de l’hydrogel gélatine-NB se transforme en un groupe NB immédiatement après l’irradiation UV, puis le groupe aldéhyde actif peut être réticulé avec un groupe amino pour former une base de Schiff.

Discussion

Les matériaux adhésifs sont une nouvelle classe de matériaux. De plus en plus de chercheurs sont engagés dans la synthèse de divers types de matériaux adhésifs et tentent de trouver leurs applications en biotechnologie, en génie tissulaire, en médecine régénérative et dans d’autres domaines, ce qui a conduit à un développement vigoureux ces dernières années. En plus de se concentrer sur la forte adhérence des matériaux adhésifs, les chercheurs accordent également plus d’attention à d’autres pro...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC)	Aladdin	L287553
4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde	Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd	H946072
DCM	Aladdin	D154840
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	20-139
dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	PHR1553
gelatin	Sigma-Aldrich	1288485
magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
MeOH	Sigma-Aldrich	1424109
methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester	chemsrc	141333-27-9
methyl 4-bromobutyrate	Aladdin	M158832
NaBH4	Sigma-Aldrich	215511
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Aladdin	D342712
nitric acid	Sigma-Aldrich	225711
potassium carbonate	Sigma-Aldrich	209619
SEM (Nova Nano 450)	Thermo FEI	17024560
THF/EtOH	Aladdin	D380010
trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma-Aldrich	8.0826