Synthese von stark adhäsivem Hydrogel, Gelatine O-Nitrosobenzaldehyd

Zusammenfassung

Das hier vorgestellte Protokoll zeigt die Synthese eines stark adhäsiven Hydrogels Gelatine o-Nitrosobenzaldehyd (Gelatine-NB). Gelatine-NB hat eine schnelle und effiziente Gewebeadhäsionsfähigkeit, die eine starke physikalische Barriere zum Schutz von Wundoberflächen bilden kann, so dass erwartet wird, dass es auf dem Gebiet der Biotechnologie zur Reparatur von Verletzungen angewendet wird.

Zusammenfassung

Klebstoffe sind zu beliebten Biomaterialien im Bereich der Biomedizin und des Tissue Engineering geworden. In unserer früheren Arbeit haben wir ein neues Material vorgestellt - Gelatine o-Nitrosobenzaldehyd (Gelatine-NB) -, das hauptsächlich für die Geweberegeneration verwendet wird und in Tiermodellen von Hornhautverletzungen und entzündlichen Darmerkrankungen validiert wurde. Hierbei handelt es sich um ein neuartiges Hydrogel, das durch Modifikation von biologischer Gelatine mit o-Nitrosobenzaldehyd (NB) gebildet wird. Gelatine-NB wurde synthetisiert, indem die Carboxylgruppe von NB-COOH aktiviert und mit Gelatine durch 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) reagiert wurde. Die erhaltene Verbindung wurde gereinigt, um das Endprodukt zu erzeugen, das mindestens 18 Monate stabil gelagert werden kann. NB hat eine starke Adhäsion an -_NH2 auf dem Gewebe, das viele C = N-Bindungen bilden kann, wodurch die Adhäsion von Gelatine-NB an der Gewebegrenzfläche erhöht wird. Der Herstellungsprozess umfasst Schritte zur Synthese der NB-COOH-Gruppe, zur Modifikation der Gruppe, zur Synthese von Gelatine-NB und zur Reinigung der Verbindung. Ziel ist es, den spezifischen Syntheseprozess von Gelatine-NB im Detail zu beschreiben und die Anwendung von Gelatine-NB zur Schadensreparatur zu demonstrieren. Darüber hinaus wird das Protokoll vorgestellt, um die Art des von der wissenschaftlichen Gemeinschaft erstellten Materials für anwendbarere Szenarien weiter zu stärken und zu erweitern.

Einleitung

Hydrogel ist eine Art dreidimensionales Polymer, das durch Wasserquellen gebildet wird. Insbesondere Hydrogel, das aus einer extrazellulären Matrix gewonnen wird, ist aufgrund seiner hervorragenden Biokompatibilität und therapeutischen Wirksamkeit im Bereich der Biosynthese und der regenerativen Medizin weit verbreitet¹. Hydrogele wurden zur Behandlung von Magengeschwüren, Neuritis, Myokardinfarkt ^2,3,4 und anderen Krankheiten berichtet. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass Gelatine-NB das Ergebnis einer entzündungsinflammatorischen Darmerkrankung (IBD) fördern ^kann5. Zu den herkömmlichen Hydrogelen gehören Gellangummi, Gelatine, Hyaluronsäure, Polyethylenglykol (PEG), geschichtete, hydrophobe/hydrophile, Alginat/Polyacrylamid-Hydrogele, Doppelnetzwerke und polyamphotere Hydrogele⁶, die alle eine gute Histokompatibilität und mechanische Eigenschaften aufweisen. Diese traditionellen Hydrogele sind jedoch anfällig für Feuchtigkeit und Luft in der Umwelt. Wenn sie längere Zeit der Luft ausgesetzt sind, verlieren sie Wasser und trocknen. Wenn sie längere Zeit in das Wasser eingetaucht sind, nehmen sie Wasser auf und dehnen sich^{aus 7}, wodurch ihre Flexibilität und mechanische Funktion verringert wird. Darüber hinaus ist die Aufrechterhaltung der Gewebehaftung herkömmlicher Hydrogele eine große Herausforderung⁸.

Auf dieser Grundlage haben wir ein nanoskaliges Hydrogel-Gelatine-NB entworfen und synthetisiert, bei dem es sich um ein neuartiges Hydrogel handelt, das durch Modifikation von biologischer Gelatine mit NB gebildet wird (Abbildung 1). NB hat eine starke Adhäsionsfähigkeit an -_NH2 auf dem Gewebe, das eine große Anzahl von C = N-Bindungen bilden kann, wodurch die Adhäsivität der Hydrogel-Gewebe-Grenzfläche erhöht wird. Diese starke Haftung kann dazu führen, dass das Hydrogel fest an der Gewebeoberfläche haftet und so eine molekulare Beschichtung auf Nanoebene bildet. In früheren Studien des Teams wurde bestätigt, dass diese Art der modifizierten Hydrogelbeschichtung die Gewebehaftung verbessert hat⁹; Es kann stabil an Hornhaut- und Darmorganen und -geweben haften und eine entzündungshemmende, barriereisolierende und regenerationsfördernde Rolle spielen. Ziel ist es, hier den spezifischen Syntheseprozess von Gelatine-NB im Detail vorzustellen, so dass Gelatine-NB in mehr Szenarien der Schadensbehebung eingesetzt werden kann. Darüber hinaus ermutigen wir andere Forscher, die Natur dieses Materials weiter zu stärken und zu erweitern, um mehr Anwendungsszenarien gerecht zu werden.

Protokoll

Die C57BL/6-Mäuse wurden von der Zhejiang University School of Medicine Sir Run Run Shaw Hospital gekauft. Die neuseeländischen Kaninchen wurden von der Zhejiang University gekauft. Die Tiere wurden unter natürlichen Hell-Dunkel-Zyklusbedingungen gehalten und erhielten frei Futter und Trinkwasser. Alle experimentellen Verfahren wurden ethisch durch die institutionellen Richtlinien der Standardrichtlinien der Ethikkommission der Zhejiang University (ZJU20200156) und des Sir Run Run Shaw Hospital Animal Care and Use Committee der Zhejiang University School of Medicine genehmigt, die dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (SRRSH202107106) entsprachen.

1. Synthese von NB-COOH

1. Bereiten Sie 4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyd (8,90 g, 58,5 mM, 1,06 Äquivalente [Gl.]), Kaliumcarbonat (10,2 g, 73,8 mM, 1,34 Äq.) und Methyl-4-Brombutyrat (9,89 g, 55,0 mM, 1,0 Äq.) basierend auf dem in der vorherigen Studie vorgeschlagenen Protokoll^{vor 10}. Die Verbindungen werden in 40 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und 16 h bei Raumtemperatur gerührt.
2. 200 ml 0 °C heißes Wasser werden in das Gemisch gegeben und das Gemisch gefällt, um ein Rohprodukt zu erhalten.
3. Das Rohprodukt wird wiederholt in DMF gelöst und dann fünf Zyklen lang ausgefällt. Das Rohprodukt fällt aus und trocknet es 2 h lang bei 80 °C, um das frühe Produkt zu erhalten.

2. Chemische Modifikation und Verarbeitung

1. Führen Sie die ipso-Substitution von Methyl-4-(4-formyl-2-methoxyphenoxymethoxyphenyl)butansäuremethylester wie unten beschrieben durch.
2. 9,4 g Methyl-4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy)butanoat (37,3 mM, 1 Äq.) langsam in eine vorgekühlte (-2 °C) Lösung von 70%iger Salpetersäure (140 ml) geben und bei -2 °C 3 h rühren.
   HINWEIS: Abhängig von der Temperatur der Nitrierungsreaktion erfolgt die ipso-Substitution des Formylanteils.
3. Filtrieren Sie die Mischung (~9,0 g) mit 200 ml 0 °C heißem Wasser und reinigen Sie sie dann in DMF, um ein festes Produkt auszufällen.
4. Das feste Produkt wird in Trifluoressigsäure (TFA)/_H2O, 1:10 v/v (100 mL) bei 90 °C hydrolysiert und getrocknet. Entfernen Sie das Lösungsmittel unter 80 kPa, um das Endprodukt zu erhalten, ein trockenes hellgelbes Pulver.
5. Das Zwischenprodukt (7,4 g, 23,8 mM, 1,0 Äq.) wird in Tetrahydrofuran (THF)/Ethanol 1:1 v/v (100 ml) gelöst. Anschließend werden 1,43 g NaBH4 (35,7 mM, 1,5 Äq.) langsam bei 0 °C zugegeben. Entfernen Sie nach 3 h alle Lösungsmittel unter Vakuum und suspendieren Sie den Rückstand in einer 1:1-Lösung aus Wasser und Dichlormethan (je 50 ml).
6. Bereiten Sie Dichlormethan vor, um das Produkt aus der wässrigen Schicht zu extrahieren. Entfernen Sie die organische Schicht und trocknen Sie sie über Magnesiumsulfat.
7. Reinigung des Rohprodukts durch Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung von DCM/MeOH im Verhältnis 10:1 (1% TEA). Schließlich erhält man 5,31 g (18,6 mM, 78,3%) relativ reines gelbliches Pulver NB-COOH.

3. Synthese von Gelatine-NB

1. Bereiten Sie 5 g Gelatine für eine Modifikationscharge vor. Es wird eine homogene Gelatinelösung hergestellt, indem 5 g Gelatine in 100 ml deionisiertem Wasser gelöst und bei 37 °C gelagert werden.
   HINWEIS: Hier werden die ursprünglichen 33 x 10-5 Mol ^{ε-Aminogruppen} /g Gelatine¹¹ definiert.
2. Definieren Sie das Zufuhrverhältnis (FR) als das molare Verhältnis zwischen NB-Gruppen und primären Aminogruppen in Gelatine. In dieser Studie wurden 53 mg NB mit 1 g Gelatine als FR_NB = 1 definiert.
3. 1.060 mg NB-COOH werden in 5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, um die Carboxylgruppen von NB-COOH zu aktivieren. Da die NB-Gruppe in Lösung empfindlich auf ultraviolettes (UV) Licht reagiert, halten Sie sie immer von Licht fern.
4. 746 mg 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimidhydrochlorid (EDC) in die NB-COOH DMSO-Lösung geben und 5 min rühren. Nachdem sich EDC aufgelöst hat, 448 mg N-Hydroxysuccinimid (NHS) zugeben und 5 Minuten rühren.
5. Verwenden Sie einen Tropftrichter, um die Mischung langsam mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min unter kräftigem Rühren in die gelöste Gelatinelösung zu tropfen, um bei 45 °C für 4 h zu reagieren.

4. Reinigung und Lagerung des Produkts

1. Dialysieren Sie die Gelatine-NB-Lösung mindestens 3 Tage lang gegen überschüssiges deionisiertes Wasser, sammeln Sie sie dann, frieren Sie sie ein und lyophilisieren Sie sie, um die Gelatine-NB-Schäume zu erhalten. Bewahren Sie die Schäume zur weiteren Verwendung in einem Exsikkator im Dunkeln auf.
2. Lösen Sie die gefriergetrockneten Gelatine-NB-Schäume unmittelbar vor Gebrauch in deionisiertem Wasser bei 37 °C auf.

Ergebnisse

Abbildung 2A zeigt ein Schema der wichtigsten chemischen Reaktionen, die an der Synthese von Gelatine-NB beteiligt sind, die die Gewebeintegration durch Pfropfen von NB-Gruppen auf Gelatine fördert. Abbildung 2B zeigt, dass sich das O-Nitrobenzol des Gelatine-NB-Hydrogels unmittelbar nach der UV-Bestrahlung in eine NB-Gruppe umwandelt und dann die aktive Aldehydgruppe mit einer Aminogruppe vernetzt werden kann, um eine Schiff-Base zu bilden.

Diskussion

Klebstoffe sind eine neue Materialklasse. Immer mehr Forscher widmen sich der Synthese verschiedener Arten von Klebstoffen und versuchen, ihre Anwendungen in der Biotechnologie, im Tissue Engineering, in der regenerativen Medizin und in anderen Bereichen zu finden, was in den letzten Jahren zu einer starken Entwicklung geführt hat. Neben der starken Haftung von Klebstoffen achten die Forscher auch verstärkt auf andere Eigenschaften wie Injektionsfähigkeit, Selbstheilung, Blutstillung, antibakterielle, kontrollierte En...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC)	Aladdin	L287553
4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde	Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd	H946072
DCM	Aladdin	D154840
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	20-139
dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	PHR1553
gelatin	Sigma-Aldrich	1288485
magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
MeOH	Sigma-Aldrich	1424109
methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester	chemsrc	141333-27-9
methyl 4-bromobutyrate	Aladdin	M158832
NaBH4	Sigma-Aldrich	215511
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Aladdin	D342712
nitric acid	Sigma-Aldrich	225711
potassium carbonate	Sigma-Aldrich	209619
SEM (Nova Nano 450)	Thermo FEI	17024560
THF/EtOH	Aladdin	D380010
trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma-Aldrich	8.0826