Sintesi di idrogel adesivo forte, gelatina O-nitrosobenzaldeide

Riepilogo

Il protocollo qui presentato mostra la sintesi di un forte idrogel adesivo gelatina o-nitrosobenzaldeide (gelatina-NB). La gelatina-NB ha una capacità di adesione tissutale rapida ed efficiente, che può formare una forte barriera fisica per proteggere le superfici delle ferite, quindi dovrebbe essere applicata al campo della biotecnologia per la riparazione delle lesioni.

Abstract

I materiali adesivi sono diventati biomateriali popolari nel campo dell'ingegneria biomedica e tissutale. Nel nostro lavoro precedente, abbiamo presentato un nuovo materiale - gelatina o-nitrosobenzaldeide (gelatina-NB) - che viene utilizzato principalmente per la rigenerazione dei tessuti ed è stato convalidato in modelli animali di lesioni corneali e malattie infiammatorie intestinali. Questo è un nuovo idrogel formato modificando la gelatina biologica con o-nitrosobenzaldeide (NB). La gelatina-NB è stata sintetizzata attivando il gruppo carbossilico di NB-COOH e reagendo con la gelatina attraverso 1-(3-dimetilamminopropil)-3-etilcarbodiimmide cloridrato (EDC) e N-idrossisuccinimide (NHS). Il composto ottenuto è stato purificato per generare il prodotto finale, che può essere conservato stabilmente per almeno 18 mesi. NB ha una forte adesione a -NH₂ sul tessuto, che può formare molti legami C = N, aumentando così l'adesione della gelatina-NB all'interfaccia tissutale. Il processo di preparazione comprende fasi per la sintesi del gruppo NB-COOH, la modifica del gruppo, la sintesi della gelatina-NB e la purificazione del composto. L'obiettivo è descrivere in dettaglio il processo di sintesi specifico della gelatina-NB e dimostrare l'applicazione della gelatina-NB per riparare i danni. Inoltre, il protocollo è presentato per rafforzare ed espandere ulteriormente la natura del materiale prodotto dalla comunità scientifica per scenari più applicabili.

Introduzione

L'idrogel è un tipo di polimero tridimensionale formato dal rigonfiamento dell'acqua. In particolare, l'idrogel derivato da una matrice extracellulare è ampiamente utilizzato nel campo della biosintesi e della medicina rigenerativa per la sua eccellente biocompatibilità ed efficacia terapeutica¹. Sono stati segnalati idrogel per il trattamento di ulcere gastriche, neuriti, infarto miocardico ^2,3,4 e altre malattie. Inoltre, è stato dimostrato che la gelatina-NB può promuovere l'esito della malattia infiammatoria intestinale infiammatoria (IBD)⁵. Gli idrogel tradizionali includono gomma di gellano, gelatina, acido ialuronico, glicole polietilenico (PEG), stratificato, idrofobo / idrofilo, alginato / poliacrilammide, doppia rete e idrogel polianfotero⁶, tutti con buona istocompatibilità e proprietà meccaniche. Tuttavia, questi idrogel tradizionali sono vulnerabili all'umidità e all'aria nell'ambiente. Se sono esposti all'aria per lungo tempo, perderanno acqua e si asciugheranno; Se sono immersi nell'acqua per lungo tempo, assorbiranno acqua e si espanderanno⁷, riducendo così la loro flessibilità e funzione meccanica. Inoltre, mantenere l'adesione tissutale degli idrogel convenzionali è una grande sfida⁸.

Sulla base di questo, abbiamo progettato e sintetizzato una gelatina idrogel su scala nanometrica-NB, che è un nuovo idrogel formato modificando la gelatina biologica con NB (Figura 1). NB ha una forte capacità di adesione a -NH₂ sul tessuto, che può formare un gran numero di legami C = N, aumentando così l'adesività dell'interfaccia idrogel-tessuto. Questa forte adesione può far aderire saldamente l'idrogel alla superficie del tessuto, formando così un rivestimento molecolare a livello nanometrico. Negli studi precedenti del team, è stato confermato che questo tipo di rivestimento idrogel modificato ha migliorato l'adesione dei tessuti⁹; Può aderire stabilmente agli organi e ai tessuti corneali e intestinali e svolgere ruoli anti-infiammatori, isolamento della barriera e promozione della rigenerazione. L'obiettivo è quello di introdurre il processo di sintesi specifico della gelatina-NB in dettaglio qui, in modo che la gelatina-NB possa essere applicata in più scenari di riparazione dei danni. Inoltre, incoraggiamo altri ricercatori a rafforzare ed espandere ulteriormente la natura di questo materiale per adattarsi a più scenari applicativi.

Protocollo

I topi C57BL / 6 sono stati acquistati dalla Zhejiang University School of Medicine Sir Run Run Shaw Hospital. I conigli neozelandesi sono stati acquistati dall'Università di Zhejiang. Gli animali sono stati mantenuti in condizioni naturali di ciclo luce-buio e hanno ricevuto cibo e acqua potabile liberamente. Tutte le procedure sperimentali sono state approvate eticamente dalle linee guida istituzionali delle linee guida standard del Comitato etico dell'Università di Zhejiang (ZJU20200156) e della Scuola di medicina dell'Università di Zhejiang Sir Run Run Shaw Hospital Animal Care and Use Committee, conformi alla Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (SRRSH202107106).

1. Sintesi di NB-COOH

1. Preparare 4-idrossi-3-(metossi-D3) benzaldeide (8,90 g, 58,5 mM, 1,06 equivalenti [eq.]), carbonato di potassio (10,2 g, 73,8 mM, 1,34 eq.) e 4-bromobutirrato di metile (9,89 g, 55,0 mM, 1,0 eq.) sulla base del protocollo proposto nello studio precedente¹⁰. Sciogliere i composti in 40 ml di N, N-dimetilformammide (DMF) e mescolare a temperatura ambiente per 16 ore.
2. Aggiungere 200 ml di acqua a 0 °C alla miscela e far precipitare la miscela fino ad ottenere un prodotto grezzo.
3. Sciogliere ripetutamente il prodotto grezzo in DMF e quindi precipitare per cinque cicli. Far precipitare il prodotto grezzo ed essiccarlo a 80 °C per 2 ore per ottenere il prodotto precoce.

2. Modifica chimica e lavorazione

1. Effettuare la sostituzione ipso dell'estere metilico dell'acido 4-(4-formil-2-metossifenossi metossifenil) butanoico come descritto di seguito.
2. Aggiungere 9,4 g di metil 4-(4-formil-2-metossifenossi) butanoato (37,3 mM, 1 eq.) lentamente ad una soluzione preraffreddata (-2 °C) di acido nitrico al 70% (140 mL) e agitare a -2 °C per 3 ore.
   NOTA: A seconda della temperatura della reazione di nitrazione, si verificherà la sostituzione ipso della frazione formilica.
3. Filtrare la miscela (~9,0 g) con 200 ml di acqua a 0 °C, quindi purificarla in DMF per precipitare un prodotto solido.
4. Idrolizzare il prodotto solido in acido trifluoroacetico (TFA)/H₂O, 1:10 v/v (100 mL) a 90 °C e asciugare. Rimuovere il solvente sotto 80 kPa per ottenere il prodotto intermedio finale, una polvere secca giallo pallido.
5. Sciogliere il prodotto intermedio (7,4 g, 23,8 mM, 1,0 eq.) in tetraidrofurano (THF)/etanolo, 1:1 v/v (100 mL). Quindi aggiungere 1,43 g di NaBH₄ (35,7 mM, 1,5 eq.) lentamente a 0 °C. Dopo 3 ore, rimuovere tutti i solventi sotto vuoto e sospendere il residuo in una soluzione di acqua 1:1 e diclorometano (50 ml ciascuno).
6. Preparare il diclorometano per estrarre il prodotto dallo strato acquoso. Rimuovere lo strato organico e asciugare sul solfato di magnesio.
7. Purificare il prodotto grezzo mediante cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando DCM/MeOH in rapporto 10:1 (1% TEA). Infine, ottenere 5,31 g (18,6 mM, 78,3%) di polvere giallastra relativamente pura NB-COOH.

3. Sintesi della gelatina-NB

1. Preparare 5 g di gelatina per un lotto di modifica. Preparare una soluzione omogenea di gelatina sciogliendo 5 g di gelatina in 100 ml di acqua deionizzata e conservare a 37 °C.
   NOTA: Qui sono definiti i gruppi originali 33 x 10-5 moli ^ε-ammino /g gelatina¹¹ .
2. Definire il rapporto di alimentazione (FR) come il rapporto molare tra i gruppi NB e i gruppi amminici primari nella gelatina. In questo studio, 53 mg di NB con 1 g di gelatina sono stati definiti come FR_NB = 1.
3. Sciogliere 1.060 mg di NB-COOH in 5 ml di dimetilsolfossido (DMSO) per attivare i gruppi carbossilici di NB-COOH. Poiché il gruppo NB è sensibile alla luce ultravioletta (UV) quando è in soluzione, tenerlo sempre lontano dalla luce.
4. Aggiungere 746 mg di 1-(3-dimetilamminopropil)-3-etilcarbodimide cloridrato (EDC) nella soluzione di NB-COOH DMSO e agitare per 5 minuti. Dopo che l'EDC si è sciolto, aggiungere 448 mg di N-idrossisuccinimide (NHS) e mescolare per 5 minuti.
5. Utilizzare un imbuto gocciolante per far cadere lentamente la miscela ad una velocità di 0,5 ml/min nella soluzione di gelatina disciolta agitando vigorosamente per reagire a 45 °C per 4 ore.

4. Purificazione e conservazione del prodotto

1. Dializzare la soluzione di gelatina-NB contro l'acqua deionizzata in eccesso per almeno 3 giorni, quindi raccoglierla, congelarla e liofilizzarla per ottenere le schiume gelatina-NB. Tenere le schiume in un essiccatore al buio per un ulteriore utilizzo.
2. Sciogliere le schiume di gelatina NB liofilizzate in acqua deionizzata a 37 °C, immediatamente prima dell'uso.

Risultati

La figura 2A mostra uno schema delle principali reazioni chimiche coinvolte nella sintesi della gelatina-NB, che promuove l'integrazione tissutale innestando gruppi NB sulla gelatina. La figura 2B mostra che l'O-nitrobenzene dell'idrogel gelatina-NB si converte in un gruppo NB immediatamente dopo l'irradiazione UV, e quindi il gruppo aldeide attivo può essere reticolato con un gruppo amminico per formare una base di Schiff. La figura 2C

Discussione

I materiali adesivi sono una nuova classe di materiali. Sempre più ricercatori sono impegnati nella sintesi di vari tipi di materiali adesivi e stanno cercando di trovare le loro applicazioni in biotecnologia, ingegneria tissutale, medicina rigenerativa e altri campi, che ha portato a un vigoroso sviluppo negli ultimi anni. Oltre a concentrarsi sulla forte adesione dei materiali adesivi, i ricercatori stanno anche prestando maggiore attenzione ad altre proprietà, come l'iniettabilità, l'auto-guarigione, l'emostatico, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC)	Aladdin	L287553
4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde	Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd	H946072
DCM	Aladdin	D154840
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	20-139
dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	PHR1553
gelatin	Sigma-Aldrich	1288485
magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
MeOH	Sigma-Aldrich	1424109
methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester	chemsrc	141333-27-9
methyl 4-bromobutyrate	Aladdin	M158832
NaBH4	Sigma-Aldrich	215511
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Aladdin	D342712
nitric acid	Sigma-Aldrich	225711
potassium carbonate	Sigma-Aldrich	209619
SEM (Nova Nano 450)	Thermo FEI	17024560
THF/EtOH	Aladdin	D380010
trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma-Aldrich	8.0826