Güçlü yapışkan hidrojel, jelatin o-nitrosobenzaldehit sentezi

Özet

Burada sunulan protokol, güçlü bir yapışkan hidrojel jelatin o-nitrosobenzaldehitin (jelatin-NB) sentezini göstermektedir. Jelatin-NB, yara yüzeylerini korumak için güçlü bir fiziksel bariyer oluşturabilen hızlı ve etkili doku yapışma yeteneğine sahiptir, bu nedenle yaralanma onarımı biyoteknolojisi alanına uygulanması beklenmektedir.

Özet

Yapışkan malzemeler, biyomedikal ve doku mühendisliği alanında popüler biyomalzemeler haline gelmiştir. Önceki çalışmamızda, esas olarak doku rejenerasyonu için kullanılan ve kornea hasarı ve enflamatuar bağırsak hastalığının hayvan modellerinde doğrulanan yeni bir materyal - jelatin o-nitrosobenzaldehit (jelatin-NB) - sunduk. Bu, biyolojik jelatinin o-nitrosobenzaldehit (NB) ile modifiye edilmesiyle oluşan yeni bir hidrojeldir. Jelatin-NB, NB-COOH'un karboksil grubunu aktive ederek ve jelatin ile 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidroklorür (EDC) ve N-hidroksisüksinimid (NHS) yoluyla reaksiyona girerek sentezlendi. Elde edilen bileşik, en az 18 ay boyunca istikrarlı bir şekilde saklanabilen nihai ürünü üretmek için saflaştırıldı. NB, doku üzerinde -NH_2'ye güçlü bir yapışmaya sahiptir, bu da birçok C = N bağı oluşturabilir, böylece jelatin-NB'nin doku arayüzüne yapışmasını arttırır. Hazırlama süreci, NB-COOH grubunun sentezi, grubun modifikasyonu, jelatin-NB sentezi ve bileşiğin saflaştırılması için adımları içerir. Amaç, jelatin-NB'nin spesifik sentez sürecini ayrıntılı olarak tanımlamak ve jelatin-NB'nin hasar onarımına uygulanmasını göstermektir. Ayrıca, protokol, daha uygulanabilir senaryolar için bilimsel topluluk tarafından üretilen malzemenin doğasını daha da güçlendirmek ve genişletmek için sunulmaktadır.

Giriş

Hidrojel, suyun şişmesiyle oluşan üç boyutlu bir polimer türüdür. Özellikle, hücre dışı bir matristen elde edilen hidrojel, mükemmel biyouyumluluğu ve terapötik etkinliği nedeniyle biyosentez ve rejeneratif tıp alanında yaygın olarak kullanılmaktadır¹. Gastrik ülser, nevrit, miyokard enfarktüsü ^2,3,4 ve diğer hastalıkların tedavisi için hidrojeller bildirilmiştir. Ayrıca, jelatin-NB'nin inflamasyon ininflamatuar bağırsak hastalığının (IBD) sonucunu destekleyebileceği ^{kanıtlanmıştır5}. Geleneksel hidrojeller arasında jellan zamkı, jelatin, hyaluronik asit, polietilen glikol (PEG), katmanlı, hidrofobik / hidrofilik, aljinat / poliakrilamid , çift ağ ve poliamfoterik hidrojeller⁶ bulunur ve bunların hepsi iyi histouyumluluk ve mekanik özelliklere sahiptir. Bununla birlikte, bu geleneksel hidrojeller ortamdaki neme ve havaya karşı savunmasızdır. Uzun süre havaya maruz kalırlarsa, su kaybederler ve kururlar; suya uzun süre daldırılırlarsa, suyu emer ve^7'yi genişletir, böylece esnekliklerini ve mekanik işlevlerini azaltırlar. Ek olarak, geleneksel hidrojellerin doku yapışmasını sağlamak büyük bir zorluktur⁸.

Buna dayanarak, biyolojik jelatinin NB ile modifiye edilmesiyle oluşan yeni bir hidrojel olan nano ölçekli bir hidrojel jelatin-NB tasarladık ve sentezledik (Şekil 1). NB, doku üzerinde -NH_2'ye güçlü bir yapışma kabiliyetine sahiptir, bu da çok sayıda C = N bağı oluşturabilir, böylece hidrojel-doku arayüzünün yapışkanlığını arttırır. Bu güçlü yapışma, hidrojelin doku yüzeyine sıkıca yapışmasını sağlayabilir, böylece nano düzeyde bir moleküler kaplama oluşturabilir. Ekibin önceki çalışmalarında, bu tür modifiye hidrojel kaplamanın doku yapışmasını iyileştirdiği doğrulanmıştır⁹; kornea ve bağırsak organlarına ve dokularına stabil bir şekilde yapışabilir ve anti-inflamasyon, bariyer izolasyonu ve rejenerasyon teşvik rolleri oynayabilir. Amaç, jelatin-NB'nin spesifik sentez işlemini burada ayrıntılı olarak tanıtmaktır, böylece jelatin-NB daha fazla hasar onarımı senaryosunda uygulanabilir. Ayrıca, diğer araştırmacıları bu malzemenin doğasını daha fazla uygulama senaryosuna uyacak şekilde daha da güçlendirmeye ve genişletmeye teşvik ediyoruz.

Protokol

C57BL / 6 fareleri, Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi Sir Run Run Shaw Hastanesi'nden satın alındı. Yeni Zelanda tavşanları Zhejiang Üniversitesi'nden satın alındı. Hayvanlar doğal ışık-karanlık döngü koşullarında tutuldu ve serbestçe yiyecek ve içme suyu verildi. Tüm deneysel prosedürler, Zhejiang Üniversitesi Etik Komitesi standart kılavuzlarının (ZJU20200156) ve Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi Sir Run Run Shaw Hastanesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin kurumsal kılavuzları tarafından etik olarak onaylanmıştır.

1. NB-COOH sentezi

1. Önceki çalışmada önerilen protokole dayanarak 4-hidroksi-3-(metoksi-D3) benzaldehit (8.90 g, 58.5 mM, 1.06 eşdeğeri [eq.]), potasyum karbonat (10.2 g, 73.8 mM, 1.34 eq.) ve metil 4-bromobutirat (9.89 g, 55.0 mM, 1.0 eq.) hazırlayın¹⁰. Bileşikleri 40 mL N, N-dimetilformamid (DMF) içinde çözün ve ortam sıcaklığında 16 saat karıştırın.
2. Karışıma 200 mL 0 °C su ekleyin ve ham bir ürün elde etmek için karışımı çökeltin.
3. Ham ürünü DMF'de tekrar tekrar çözün ve ardından beş döngü boyunca çökeltin. Ham ürünü çökeltin ve erken ürünü elde etmek için 80 ° C'de 2 saat kurutun.

2. Kimyasal modifikasyon ve işleme

1. Aşağıda açıklandığı gibi metil 4-(4-formil-2-metoksifenoksifenil) butanoik asit metil esterin ipso ikamesini gerçekleştirin.
2. % 70 nitrik asit (140 mL) önceden soğutulmuş (-2 °C) çözeltisine yavaşça 9.4 g metil 4-(4-formil-2-metoksifenoksi) butanoat (37.3 mM, 1 eq.) ekleyin ve 3 saat boyunca -2 °C'de karıştırın.
   NOT: Nitrasyon reaksiyonunun sıcaklığına bağlı olarak, formil moiety'nin ipso ikamesi gerçekleşecektir.
3. Karışımı (~ 9.0 g) 200 mL 0 °C su ile süzün, ardından katı bir ürünü çökeltmek için DMF'de saflaştırın.
4. Katı ürünü trifloroasetik asit (TFA)/H₂O, 1:10 v/v (100 mL) içinde 90 °C'de hidrolize edin ve kurutun. Son ara ürün, kuru soluk sarı bir toz elde etmek için çözücüyü 80 kPa'nın altında çıkarın.
5. Ara ürünü (7,4 g, 23,8 mM, 1,0 eq.) tetrahidrofuran (THF)/etanol, 1:1 v/v (100 mL) içinde çözün. Daha sonra 0 °C'de yavaşça_1,43 g NaBH 4 (35,7 mM, 1,5 eq.) ekleyin. 3 saat sonra, tüm çözücüleri bir vakum altında çıkarın ve kalıntıyı 1: 1 su ve diklorometan çözeltisinde (her biri 50 mL) askıya alın.
6. Ürünü sulu tabakadan çıkarmak için diklorometan hazırlayın. Organik tabakayı çıkarın ve magnezyum sülfat üzerinde kurutun.
7. Ham ürünü, DCM / MeOH kullanarak 10: 1 oranında (% 1 TEA) silika jel kolon kromatografisi ile saflaştırın. Son olarak, 5.31 g (18.6 mM, 78.3%) nispeten saf sarımsı toz NB-COOH elde edin.

3. Jelatin-NB sentezi

1. Bir parti modifikasyon için 5 g jelatin hazırlayın. 5 g jelatini 100 mL deiyonize suda eriterek homojen bir jelatin çözeltisi hazırlayın ve 37 °C'de saklayın.
   NOT: Burada, orijinal 33 x 10-5 mol ^ε-amino grupları/g jelatin¹¹ tanımlanmıştır.
2. Besleme oranını (FR), jelatindeki NB grupları ve primer amino grupları arasındaki molar oran olarak tanımlayın. Bu çalışmada 1 g jelatin içeren 53 mg NB FR_NB = 1 olarak tanımlanmıştır.
3. NB-COOH'un karboksil gruplarını aktive etmek için 5 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 1.060 mg NB-COOH çözün. NB grubu çözelti halindeyken ultraviyole (UV) ışığa duyarlı olduğundan, daima ışıktan uzak tutun.
4. NB-COOH DMSO çözeltisine 746 mg 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodimid hidroklorür (EDC) ekleyin ve 5 dakika karıştırın. EDC çözüldükten sonra, 448 mg N-hidroksisüksinamid (NHS) ekleyin ve 5 dakika karıştırın.
5. Karışımı 0,5 mL/dak hızında, 4 saat boyunca 45 °C'de reaksiyona girmek üzere kuvvetli bir karıştırma ile çözünmüş jelatin çözeltisine yavaşça düşürmek için bir damlama hunisi kullanın.

4. Ürünün saflaştırılması ve depolanması

1. Jelatin-NB çözeltisini aşırı deiyonize suya karşı en az 3 gün boyunca diyalize edin, daha sonra jelatin-NB köpüklerini elde etmek için toplayın, dondurun ve liyofilize edin. Daha fazla kullanım için köpükleri karanlıkta bir kurutucuda tutun.
2. Dondurularak kurutulmuş jelatin-NB köpükleri, kullanımdan hemen önce, 37 °C'de deiyonize suda çözün.

Sonuçlar

Şekil 2A , NB gruplarını jelatin üzerine aşılayarak doku entegrasyonunu teşvik eden jelatin-NB sentezinde yer alan ana kimyasal reaksiyonların bir şemasını göstermektedir. Şekil 2B, jelatin-NB hidrojelinin O-nitrobenzenin, UV ışınlamasından hemen sonra bir NB grubuna dönüştüğünü ve daha sonra aktif aldehit grubunun bir Schiff tabanı oluşturmak için bir amino grubuyla çapraz bağlanabileceğini göstermektedir. Şe...

Tartışmalar

Yapışkan malzemeler yeni bir malzeme sınıfıdır. Giderek daha fazla araştırmacı, çeşitli yapışkan malzemelerin sentezine kendini adamıştır ve biyoteknoloji, doku mühendisliği, rejeneratif tıp ve son yıllarda güçlü bir gelişmeye yol açan diğer alanlarda uygulamalarını bulmaya çalışmaktadır. Yapışkan malzemelerin güçlü yapışmasına odaklanmanın yanı sıra, araştırmacılar ayrıca enjekte edilebilirlik, kendi kendini iyileştirme, hemostatik, antibakteriyel, kontrollü çıkarma ve ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC)	Aladdin	L287553
4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde	Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd	H946072
DCM	Aladdin	D154840
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	20-139
dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	PHR1553
gelatin	Sigma-Aldrich	1288485
magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
MeOH	Sigma-Aldrich	1424109
methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester	chemsrc	141333-27-9
methyl 4-bromobutyrate	Aladdin	M158832
NaBH4	Sigma-Aldrich	215511
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Aladdin	D342712
nitric acid	Sigma-Aldrich	225711
potassium carbonate	Sigma-Aldrich	209619
SEM (Nova Nano 450)	Thermo FEI	17024560
THF/EtOH	Aladdin	D380010
trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma-Aldrich	8.0826