강력한 접착력 하이드로겔, 젤라틴 O-니트로소벤즈알데히드의 합성

요약

여기에 제시된 프로토콜은 강력한 접착성 하이드로겔 젤라틴 o-니트로소벤즈알데히드(젤라틴-NB)의 합성을 보여줍니다. Gelatin-NB는 빠르고 효율적인 조직 접착 능력을 가지고 있어 상처 표면을 보호하기 위해 강력한 물리적 장벽을 형성할 수 있으므로 부상 복구 생명 공학 분야에 적용될 것으로 기대됩니다.

초록

접착 재료는 생물 의학 및 조직 공학 분야에서 널리 사용되는 생체 재료가되었습니다. 이전 연구에서 우리는 주로 조직 재생에 사용되며 각막 손상 및 염증성 장 질환의 동물 모델에서 검증된 새로운 물질인 젤라틴 o-니트로소벤즈알데히드(젤라틴-NB)를 제시했습니다. 이것은 생물학적 젤라틴을 o-니트로소벤즈알데히드(NB)로 변형하여 형성된 새로운 하이드로겔입니다. 젤라틴-NB는 NB-COOH의 카르복실기를 활성화하고 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 통해 젤라틴과 반응시켜 합성되었습니다. 얻어진 화합물을 정제하여 최종 생성물을 생성하고, 이는 적어도 18개월 동안 안정하게 저장될 수 있다. NB는 조직 상의 -_NH2 에 대해 강한 접착력을 가지며, 이는 많은 C=N 결합을 형성할 수 있고, 따라서 조직 계면에 대한 젤라틴-NB의 접착을 증가시킨다. 제조 공정은 NB-COOH 기의 합성, 기의 변형, 젤라틴-NB 화합물의 합성 및 정제를 위한 단계를 포함한다. 목표는 젤라틴-NB의 특정 합성 과정을 자세히 설명하고 손상 복구에 젤라틴-NB를 적용하는 것을 입증하는 것입니다. 또한, 이 프로토콜은 보다 적용 가능한 시나리오를 위해 과학계에서 생산한 자료의 특성을 더욱 강화하고 확장하기 위해 제시됩니다.

서문

하이드로겔은 물이 팽윤되어 형성된 3차원 폴리머의 일종입니다. 특히, 세포외기질 유래의 하이드로젤은 우수한 생체적합성 및 치료효과로 인해 생합성 및 재생의학 분야에서 널리 사용되고 있다¹. 하이드로겔은 위궤양, 신경염, 심근경색 ^2,3,4 및 기타 질환의 치료에 대해 보고되었다. 또한, 젤라틴-NB가 염증성 염증성 장 질환(IBD)의 결과를 촉진할 수 있음^{이 입증되었습니다5}. 전통적인 하이드로겔에는 젤란검, 젤라틴, 히알루론산, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 층상, 소수성/친수성, 알지네이트/폴리아크릴아미드, 이중 네트워크 및 다양쪽성 하이드로겔⁶이 포함되며, 이들 모두는 우수한 조직적합성 및 기계적 특성을 가지고 있다. 그러나 이러한 전통적인 하이드로겔은 환경의 습기와 공기에 취약합니다. 장시간 공기에 노출되면 물이 없어지고 건조해집니다. 장시간 물에 담그면 물을 흡수하고^{팽창하여 7}, 따라서 유연성과 기계적 기능이 감소합니다. 또한, 종래의 하이드로겔의 조직 부착을 유지하는 것은 주요한 과제이다⁸.

이를 바탕으로 생물학적 젤라틴을 NB로 변형하여 형성된 새로운 하이드로겔인 나노스케일 하이드로겔 젤라틴-NB를 설계하고 합성했습니다(그림 1). NB는 조직 상의 -_NH2 에 대한 강한 접착 능력을 가지며, 이는 많은 수의 C=N 결합을 형성할 수 있고, 따라서 하이드로겔-조직 계면의 접착성을 증가시킨다. 이 강한 접착력은 하이드로겔을 조직 표면에 단단히 부착시켜 나노 수준의 분자 코팅을 형성할 수 있습니다. 연구팀의 이전 연구에서, 이러한 종류의 변형된 하이드로겔 코팅이 조직 접착력을 향상시킨다는 것이 확인되었다⁹; 각막 및 장 장기 및 조직에 안정적으로 부착할 수 있으며 항염, 장벽 격리 및 재생 촉진 역할을 합니다. 목표는 젤라틴-NB의 특정 합성 과정을 여기에 자세히 소개하여 젤라틴-NB가 손상 복구의 더 많은 시나리오에 적용될 수 있도록 하는 것입니다. 또한, 우리는 다른 연구자들이 더 많은 응용 시나리오에 적합하도록 이 재료의 특성을 더욱 강화하고 확장할 것을 권장합니다.

프로토콜

C57BL/6 마우스는 Zhejiang University School of Medicine, Sir Run Run Shaw Hospital에서 구입하였다. 뉴질랜드 토끼는 절강 대학교에서 구입했습니다. 동물들은 자연의 빛-어둠 주기 조건에서 유지되었고 음식과 식수를 자유롭게 제공받았습니다. 모든 실험 절차는 NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(SRRSH202107106)를 준수하는 Zhejiang University Ethics Committee 표준 지침(ZJU20200156) 및 Zhejiang University School of Medicine Sir Run Run Shaw Hospital Animal Care and Use Committee의 기관 지침에 의해 윤리적으로 승인되었습니다.

1. NB-COOH의 합성

1. 4-히드록시-3-(메톡시-D3)벤즈알데히드(8.90 g, 58.5 mM, 1.06 당량[eq.]), 탄산칼륨(10.2 g, 73.8 mM, 1.34 eq.) 및 메틸 4-브로모부티레이트(9.89 g, 55.0 mM, 1.0 eq.)를 이전 연구¹⁰에서 제안된 프로토콜에 기초하여 준비한다. 화합물을 N, N-디메틸포름아미드(DMF) 40mL에 녹이고 상온에서 16시간 동안 저어줍니다.
2. 혼합물에 0°C의 물 200mL를 첨가하고 혼합물을 침전시켜 조생성물을 얻었다.
3. 원유 생성물을 DMF에 반복적으로 용해시킨 다음 5 사이클 동안 침전시킵니다. 조 생성물을 침전시키고 80°C에서 2시간 동안 건조시켜 초기 생성물을 얻는다.

2. 화학적 개질 및 가공

1. 후술하는 바와 같이 메틸 4-(4-포르밀-2-메톡시페녹시메톡시페닐)부탄산 메틸 에스테르의 입소 치환을 수행한다.
2. 9.4 g의 메틸 4-(4-포르밀-2-메톡시페녹시)부타노에이트(37.3 mM, 1 eq.)를 70% 질산(140 mL)의 예냉(-2°C) 용액에 천천히 첨가하고 -2°C에서 3시간 동안 교반한다.
   참고: 니트로화 반응의 온도에 따라 포르밀 부분의 입소 치환이 발생합니다.
3. 혼합물(~9.0g)을 0°C의 물 200mL로 여과한 다음 DMF로 정제하여 고체 생성물을 침전시킵니다.
4. 90°C에서 트리플루오로아세트산(TFA)/H_2O, 1:10 v/v(100mL)에서 고체 생성물을 가수분해하고 건조시킵니다. 용매를 80 kPa 하에서 제거하여 최종 중간 생성물인 무수 옅은 황색 분말을 얻었다.
5. 중간 생성물(7.4g, 23.8mM, 1.0당량)을 테트라히드로퓨란(THF)/에탄올, 1:1 v/v(100mL)에 녹입니다. 그런 다음 0°C에서 1.43g의_NaBH4 (35.7 mM, 1.5당량)를 천천히 첨가한다. 3시간 후, 진공 하에서 모든 용매를 제거하고 잔류물을 1:1 물과 디클로로메탄 용액(각각 50mL)에 현탁시킵니다.
6. 수성 층으로부터 생성물을 추출하기 위해 디클로로메탄을 준비한다. 유기층을 제거하고 황산마그네슘으로 건조시킵니다.
7. DCM/MeOH를 10:1 비율(1% TEA)로 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 조 생성물을 정제합니다. 마지막으로, 비교적 순수한 황색 분말 NB-COOH 5.31 g (18.6 mM, 78.3 %)을 얻는다.

3. 젤라틴-NB의 합성

1. 한 배치의 변형을 위해 5g의 젤라틴을 준비하십시오. 5 g의 젤라틴을 탈이온수 100 mL에 용해시켜 균질한 젤라틴 용액을 제조하고 37°C에서 보관한다.
   참고: 여기에서 원래 33 x 10-5 moles ε^- 아미노 그룹/g 젤라틴¹¹ 이 정의됩니다.
2. 공급 비율(FR)을 젤라틴의 NB 그룹과 1차 아미노 그룹 사이의 몰 비율로 정의합니다. 이 연구에서는 53mg의 NB와 1g의 젤라틴을 FR_NB = 1로 정의했습니다.
3. 1,060mg의 NB-COOH를 5mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹여 NB-COOH의 카르복실기를 활성화합니다. NB 그룹은 용액에 있을 때 자외선(UV)에 민감하므로 항상 빛에서 멀리 두십시오.
4. 746mg의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디미드 염산염(EDC)을 NB-COOH DMSO 용액에 넣고 5분 동안 저어줍니다. EDC가 용해되면 N-하이드록시석신이미드(NHS) 448mg을 넣고 5분 동안 저어줍니다.
5. 적하 깔때기를 사용하여 용해된 젤라틴 용액에 0.5mL/min의 속도로 혼합물을 천천히 떨어뜨리고 격렬하게 저어주면서 45°C에서 4시간 동안 반응시킵니다.

4. 제품의 정제 그리고 저장

1. 젤라틴-NB 용액을 과량의 탈이온수에 대해 최소 3일 동안 투석한 다음 수집, 동결 및 동결건조하여 젤라틴-NB 폼을 얻습니다. 추가 사용을 위해 거품을 어두운 곳에서 건조기에 보관하십시오.
2. 동결건조된 젤라틴-NB 폼을 사용 직전에 37°C에서 탈이온수에 용해시킨다.

결과

도 2A 는 젤라틴-NB의 합성에 관여하는 주요 화학 반응의 개략도를 보여주며, 이는 NB 그룹을 젤라틴에 접목함으로써 조직 통합을 촉진한다. 도 2B 는 젤라틴-NB 하이드로겔의 O-니트로벤젠이 UV 조사 직후 NB기로 전환된 후 활성 알데히드기가 아미노기와 가교되어 쉬프 염기를 형성할 수 있음을 보여준다. 도 2C 는 NB 기의 상이한 비율?...

토론

접착 재료는 새로운 종류의 재료입니다. 점점 더 많은 연구자들이 다양한 유형의 접착 재료의 합성에 전념하고 있으며 생명 공학, 조직 공학, 재생 의학 및 기타 분야에서 응용 분야를 찾기 위해 노력하고 있으며 최근 몇 년 동안 활발한 발전을 이끌었습니다. 접착 재료의 강한 접착력에 초점을 맞추는 것 외에도 연구자들은 주사 가능성, 자가 치유, 지혈, 항균, 제어 제거 등과 같은 다른 특성에도 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC)	Aladdin	L287553
4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde	Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd	H946072
DCM	Aladdin	D154840
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	20-139
dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	PHR1553
gelatin	Sigma-Aldrich	1288485
magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
MeOH	Sigma-Aldrich	1424109
methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester	chemsrc	141333-27-9
methyl 4-bromobutyrate	Aladdin	M158832
NaBH4	Sigma-Aldrich	215511
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Aladdin	D342712
nitric acid	Sigma-Aldrich	225711
potassium carbonate	Sigma-Aldrich	209619
SEM (Nova Nano 450)	Thermo FEI	17024560
THF/EtOH	Aladdin	D380010
trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma-Aldrich	8.0826