Síntesis de hidrogel adhesivo fuerte, gelatina O-nitrosobenzaldehído

Resumen

El protocolo presentado aquí muestra la síntesis de un fuerte adhesivo de gelatina de hidrogel o-nitrosobenzaldehído (gelatina-NB). La gelatina-NB tiene una capacidad de adhesión tisular rápida y eficiente, que puede formar una fuerte barrera física para proteger las superficies de las heridas, por lo que se espera que se aplique al campo de la biotecnología de reparación de lesiones.

Resumen

Los materiales adhesivos se han convertido en biomateriales populares en el campo de la ingeniería biomédica y de tejidos. En nuestro trabajo anterior, presentamos un nuevo material, gelatina o-nitrosobenzaldehído (gelatina-NB), que se utiliza principalmente para la regeneración de tejidos y ha sido validado en modelos animales de lesión corneal y enfermedad inflamatoria intestinal. Se trata de un nuevo hidrogel formado modificando la gelatina biológica con o-nitrosobenzaldehído (NB). La gelatina-NB se sintetizó activando el grupo carboxilo de NB-COOH y reaccionando con gelatina a través de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS). El compuesto obtenido se purificó para generar el producto final, que puede almacenarse de manera estable durante al menos 18 meses. NB tiene una fuerte adhesión a -NH₂ en el tejido, que puede formar muchos enlaces C = N, aumentando así la adhesión de gelatina-NB a la interfaz tisular. El proceso de preparación comprende pasos para la síntesis del grupo NB-COOH, modificación del grupo, síntesis de gelatina-NB y purificación del compuesto. El objetivo es describir el proceso de síntesis específico de gelatina-NB en detalle y demostrar la aplicación de gelatina-NB para la reparación de daños. Además, el protocolo se presenta para fortalecer y ampliar aún más la naturaleza del material producido por la comunidad científica para escenarios más aplicables.

Introducción

El hidrogel es un tipo de polímero tridimensional formado por la hinchazón del agua. En particular, el hidrogel derivado de una matriz extracelular es ampliamente utilizado en el campo de la biosíntesis y la medicina regenerativa debido a su excelente biocompatibilidad y efectividad terapéutica¹. Se han notificado hidrogeles para el tratamiento de úlceras gástricas, neuritis, infarto de miocardio ^2,3,4 y otras enfermedades. Además, se ha demostrado que la gelatina-NB puede promover el resultado de la inflamación en la enfermedad inflamatoria intestinal (EII)⁵. Los hidrogeles tradicionales incluyen goma gellan, gelatina, ácido hialurónico, polietilenglicol (PEG), en capas, hidrofóbicos / hidrófilos, alginato / poliacrilamida, doble red e hidrogeles polianfóteros⁶, todos los cuales tienen buenas propiedades histométricas y de histocompatibilidad. Sin embargo, estos hidrogeles tradicionales son vulnerables a la humedad y al aire en el medio ambiente. Si están expuestos al aire durante mucho tiempo, perderán agua y se secarán; Si se sumergen en el agua durante mucho tiempo, absorberán agua y se expandirán⁷, reduciendo así su flexibilidad y función mecánica. Además, mantener la adhesión tisular de los hidrogeles convencionales es un gran desafío⁸.

En base a esto, diseñamos y sintetizamos un hidrogel a nanoescala gelatina-NB, que es un nuevo hidrogel formado modificando la gelatina biológica con NB (Figura 1). NB tiene una fuerte capacidad de adhesión a -NH₂ en el tejido, que puede formar un gran número de enlaces C = N, aumentando así la adhesividad de la interfaz hidrogel-tejido. Esta fuerte adhesión puede hacer que el hidrogel se adhiera firmemente a la superficie del tejido, formando así un recubrimiento molecular de nivel nanométrico. En estudios previos del equipo, se ha confirmado que este tipo de recubrimiento de hidrogel modificado ha mejorado la adhesión tisular⁹; Puede adherirse de manera estable a los órganos y tejidos corneales e intestinales y desempeñar funciones antiinflamatorias, aislamiento de barrera y promoción de la regeneración. El objetivo es introducir el proceso de síntesis específico de gelatina-NB en detalle aquí, para que la gelatina-NB se pueda aplicar en más escenarios de reparación de daños. Además, alentamos a otros investigadores a fortalecer y ampliar aún más la naturaleza de este material para adaptarse a más escenarios de aplicación.

Protocolo

Los ratones C57BL / 6 fueron comprados en el Hospital Sir Run Run Shaw de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang. Los conejos de Nueva Zelanda fueron comprados a la Universidad de Zhejiang. Los animales fueron mantenidos en condiciones naturales de ciclo de luz-oscuridad y se les dio comida y agua potable libremente. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados éticamente por las directrices institucionales de las directrices estándar del Comité de Ética de la Universidad de Zhejiang (ZJU20200156) y el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Sir Run Run Shaw de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, que se ajustaron a la Guía de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio (SRRSH202107106).

1. Síntesis de NB-COOH

1. Preparar el 4-hidroxi-3-(metoxi-D3) benzaldehído (8,90 g, 58,5 mM, 1,06 equivalentes [ec.]), carbonato de potasio (10,2 g, 73,8 mM, 1,34 eq.) y metil 4-bromobutirato (9,89 g, 55,0 mM, 1,0 eq.) con base en el protocolo propuesto en el estudio anterior¹⁰. Disolver los compuestos en 40 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) y agitar a temperatura ambiente durante 16 h.
2. Añadir 200 mL de agua a 0 °C a la mezcla y precipitar la mezcla para obtener un producto crudo.
3. Disuelva repetidamente el producto crudo en DMF y luego precipite durante cinco ciclos. Precipitar el producto crudo y secarlo a 80 °C durante 2 h para obtener el producto temprano.

2. Modificación química y procesamiento

1. Realizar la sustitución ipso del éster metílico del ácido butanoico 4-(4-formil-2-metoxifenoxi metoxifenil) butanoico como se describe a continuación.
2. Añadir 9,4 g de butanoato de metilo 4-(4-formil-2-metoxifenoxi) butanoato (37,3 mM, 1 eq.) lentamente a una solución preenfriada (-2 °C) de ácido nítrico al 70% (140 ml) y agitar a -2 °C durante 3 h.
   NOTA: Dependiendo de la temperatura de la reacción de nitración, se producirá la sustitución ipso de la fracción formilo.
3. Filtrar la mezcla (~9.0 g) con 200 mL de agua a 0 °C, luego purificarla en DMF para precipitar un producto sólido.
4. Hidrolizar el producto sólido en ácido trifluoroacético (TFA)/_H2O, 1:10 v/v (100 ml) a 90 °C y seco. Eliminar el disolvente por debajo de 80 kPa para obtener el producto intermedio final, un polvo seco de color amarillo pálido.
5. Disolver el producto intermedio (7,4 g, 23,8 mM, 1,0 eq.) en tetrahidrofurano (THF)/etanol, 1:1 v/v (100 ml). A continuación, añadir 1,43 g de NaBH₄ (35,7 mM, 1,5 eq.) lentamente a 0 °C. Después de 3 h, eliminar todos los disolventes al vacío y suspender el residuo en una solución 1:1 de agua y diclorometano (50 ml cada uno).
6. Preparar diclorometano para extraer el producto de la capa acuosa. Retire la capa orgánica y seque sobre sulfato de magnesio.
7. Purificar el producto crudo mediante cromatografía en columna de gel de sílice utilizando DCM/MeOH en una proporción de 10:1 (1% TEA). Finalmente, obtenga 5,31 g (18,6 mM, 78,3%) de polvo amarillento relativamente puro NB-COOH.

3. Síntesis de gelatina-NB

1. Prepare 5 g de gelatina para un lote de modificación. Preparar una solución de gelatina homogénea disolviendo 5 g de gelatina en 100 ml de agua desionizada y almacenar a 37 °C.
   NOTA: Aquí se definen los 33 x ^10-5 moles originales ε grupos amino / g de gelatina¹¹ .
2. Defina la relación de alimentación (FR) como la relación molar entre los grupos NB y los grupos amino primarios en la gelatina. En este estudio, 53 mg de NB con 1 g de gelatina se definieron como FR_NB = 1.
3. Disuelva 1,060 mg de NB-COOH en 5 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) para activar los grupos carboxilo de NB-COOH. Dado que el grupo NB es sensible a la luz ultravioleta (UV) cuando está en solución, manténgalo siempre alejado de la luz.
4. Agregue 746 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodimida (EDC) en la solución NB-COOH DMSO y revuelva durante 5 min. Después de que la EDC se haya disuelto, agregue 448 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS) y revuelva durante 5 minutos.
5. Utilice un embudo de goteo para dejar caer lentamente la mezcla a una velocidad de 0,5 ml / min en la solución de gelatina disuelta con agitación vigorosa para reaccionar a 45 ° C durante 4 h.

4. Purificación y almacenamiento del producto

1. Dialice la solución de gelatina-NB contra el exceso de agua desionizada durante al menos 3 días, luego recoja, congele y liofilifícela para obtener las espumas de gelatina-NB. Mantenga las espumas en un desecador en la oscuridad para su uso posterior.
2. Disuelva las espumas de gelatina-NB liofilizadas en agua desionizada a 37 °C, inmediatamente antes de su uso.

Resultados

La Figura 2A muestra un esquema de las principales reacciones químicas involucradas en la síntesis de gelatina-NB, que promueve la integración tisular mediante el injerto de grupos NB en gelatina. La Figura 2B muestra que el O-nitrobenceno del hidrogel de gelatina-NB se convierte en un grupo NB inmediatamente después de la irradiación UV, y luego el grupo aldehído activo puede ser reticulado con un grupo amino para formar una base de Schiff.

Discusión

Los materiales adhesivos son una nueva clase de material. Cada vez más investigadores están comprometidos con la síntesis de varios tipos de materiales adhesivos, y están tratando de encontrar sus aplicaciones en biotecnología, ingeniería de tejidos, medicina regenerativa y otros campos, lo que ha llevado a un desarrollo vigoroso en los últimos años. Además de centrarse en la fuerte adhesión de los materiales adhesivos, los investigadores también están prestando más atención a otras propiedades, como la iny...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC)	Aladdin	L287553
4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde	Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd	H946072
DCM	Aladdin	D154840
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	20-139
dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	PHR1553
gelatin	Sigma-Aldrich	1288485
magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
MeOH	Sigma-Aldrich	1424109
methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester	chemsrc	141333-27-9
methyl 4-bromobutyrate	Aladdin	M158832
NaBH4	Sigma-Aldrich	215511
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Aladdin	D342712
nitric acid	Sigma-Aldrich	225711
potassium carbonate	Sigma-Aldrich	209619
SEM (Nova Nano 450)	Thermo FEI	17024560
THF/EtOH	Aladdin	D380010
trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma-Aldrich	8.0826