JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול המוצג כאן מראה סינתזה של ג'לטין הידרוג'ל דביק חזק o-nitrosobenzaldehyde (ג'לטין-NB). לג'לטין-NB יכולת היצמדות מהירה ויעילה של רקמות, שיכולה להוות מחסום פיזי חזק להגנה על משטחי פצעים, ולכן הוא צפוי להיות מיושם בתחום הביוטכנולוגיה לתיקון פציעות.

Abstract

חומרי הדבקה הפכו לביו-חומרים פופולריים בתחום הביו-רפואי והנדסת רקמות. בעבודתנו הקודמת הצגנו חומר חדש - ג'לטין O-nitrosobenzaldehyde (ג'לטין-NB) - המשמש בעיקר להתחדשות רקמות ואומת במודלים של בעלי חיים של פגיעה בקרנית ומחלות מעי דלקתיות. זהו הידרוג'ל חדשני שנוצר על ידי שינוי ג'לטין ביולוגי עם o-nitrosobenzaldehyde (NB). ג'לטין-NB סונתז על ידי הפעלת קבוצת הקרבוקסיל של NB-COOH ותגובה עם ג'לטין באמצעות 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) ו-N-hydroxysuccinimide (NHS). התרכובת המתקבלת טוהרה כדי ליצור את המוצר הסופי, אשר ניתן לאחסן ביציבות במשך 18 חודשים לפחות. ל-NB יש היצמדות חזקה ל-NH2 על הרקמה, מה שיכול ליצור קשרים רבים של C = N, ובכך להגדיל את ההיצמדות של ג'לטין-NB לממשק הרקמה. תהליך ההכנה כולל שלבים לסינתזה של קבוצת NB-COOH, שינוי הקבוצה, סינתזה של ג'לטין-NB וטיהור התרכובת. המטרה היא לתאר בפירוט את תהליך הסינתזה הספציפי של ג'לטין-NB ולהדגים את היישום של ג'לטין-NB לתיקון נזקים. יתר על כן, הפרוטוקול מוצג כדי לחזק ולהרחיב עוד יותר את אופי החומר המיוצר על ידי הקהילה המדעית לתרחישים ישימים יותר.

Introduction

הידרוג'ל הוא סוג של פולימר תלת מימדי שנוצר על ידי נפיחות מים. בפרט, הידרוג'ל הנגזר מטריצה חוץ-תאית נמצא בשימוש נרחב בתחום הביוסינתזה והרפואה הרגנרטיבית בגלל התאימות הביולוגית המצוינת שלוויעילותו הטיפולית 1. הידרוג'לים דווחו לטיפול בכיבי קיבה, דלקת עצבים, אוטם שריר הלב 2,3,4 ומחלות אחרות. יתר על כן, הוכח כי ג'לטין-NB יכול לקדם את התוצאה של דלקת מחלת מעי דלקתית (IBD)5. הידרוג'לים מסורתיים כוללים גאם גלן, ג'לטין, חומצה היאלורונית, פוליאתילן גליקול (PEG), שכבות, הידרופוביות/הידרופיליות, אלגינט/פוליאקרילאמיד, רשת כפולה והידרוג'לים פוליאמפוטריים6, שלכולם יש היסטותאימות טובה ותכונות מכניות. עם זאת, הידרוג'לים מסורתיים אלה פגיעים ללחות ולאוויר בסביבה. אם הם נחשפים לאוויר במשך זמן רב, הם יאבדו מים ויתייבשו; אם הם שקועים במים במשך זמן רב, הם יספגו מים ויתרחבו7, ובכך יפחיתו את גמישותם ואת תפקודם המכני. בנוסף, שמירה על הידבקות רקמות של הידרוג'לים קונבנציונליים היא אתגר גדול8.

בהתבסס על זה, תכננו וסינתזנו ג'לטין-NB הידרוג'ל ננומטרי, שהוא הידרוג'ל חדשני שנוצר על-ידי שינוי ג'לטין ביולוגי עם NB (איור 1). NB יש יכולת הדבקה חזקה ל -NH 2 על הרקמה, אשר יכול ליצור מספר רב של קשרים C = N, ובכך להגדיל את ההדבקה של ממשק רקמת הידרוג'ל. הדבקה חזקה זו יכולה לגרום להידרוג'ל להיצמד היטב לפני הרקמה, ובכך ליצור ציפוי מולקולרי ברמה ננומטרית. במחקרים קודמים של הצוות, אושר כי סוג זה של ציפוי הידרוג'ל שונה שיפר את הידבקות רקמות9; הוא יכול להיצמד ביציבות לאיברי ורקמות הקרנית והמעיים ולמלא תפקידים נגד דלקת, בידוד מחסום וקידום התחדשות. המטרה היא להציג את תהליך הסינתזה הספציפי של ג'לטין-NB בפירוט כאן, כך שניתן יהיה ליישם את הג'לטין-NB בתרחישים נוספים של תיקון נזקים. יתר על כן, אנו מעודדים חוקרים אחרים לחזק ולהרחיב עוד יותר את אופי החומר הזה כדי להתאים לתרחישי יישום נוספים.

Protocol

עכברי C57BL/6 נרכשו מבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ג'יאנג בבית החולים סר ראן ראן שו. הארנבים הניו זילנדים נרכשו מאוניברסיטת ג'ג'יאנג. בעלי החיים הוחזקו בתנאי מחזור טבעי של אור-חושך וקיבלו מזון ומי שתייה באופן חופשי. כל הליכי הניסוי אושרו באופן אתי על ידי ההנחיות המוסדיות של הנחיות התקן של ועדת האתיקה של אוניברסיטת ג'ג'יאנג (ZJU20200156) ובית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ג'יאנג סר ראן ראן ראן שו בית החולים טיפול ושימוש בבעלי חיים, אשר התאימו למדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (SRRSH202107106).

1. סינתזה של NB-COOH

  1. הכינו 4-הידרוקסי-3-(מתוקסי-D3) בנזלדהיד (8.90 גרם, 58.5 מילימול, 1.06 שווה ערך [eq.]), אשלגן פחמתי (10.2 גרם, 73.8 מילימול, 1.34 eq.) ומתיל 4-ברומובוטיראט (9.89 גרם, 55.0 מילימול, 1.0 eq.) בהתבסס על הפרוטוקול שהוצע במחקרהקודם 10. ממיסים את התרכובות ב-40 מ"ל N, N-דימתילפורממיד (DMF) ומערבבים בטמפרטורת הסביבה במשך 16 שעות.
  2. הוסף 200 מ"ל של מים 0 °C לתערובת לזרז את התערובת כדי לקבל מוצר גולמי.
  3. יש להמיס שוב ושוב את המוצר הגולמי ב-DMF ולאחר מכן לזרז במשך חמישה מחזורים. לזרז את המוצר הגולמי ולייבש אותו ב 80 ° C במשך 2 שעות כדי לקבל את המוצר המוקדם.

2. שינוי ועיבוד כימי

  1. בצע את החלפת ipso של מתיל 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester כמתואר להלן.
  2. הוסף 9.4 גרם של מתיל 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy) butanoate (37.3 mM, 1 eq.) באיטיות לתמיסה מקוררת מראש (-2 ° C) של 70% חומצה חנקתית (140 מ"ל) וערבבו ב -2 ° C במשך 3 שעות.
    הערה: בהתאם לטמפרטורה של תגובת הניטרציה, החלפת ipso של moiety פורמיל יתרחש.
  3. סנן את התערובת (~ 9.0 גרם) עם 200 מ"ל של 0 ° C מים, ולאחר מכן לטהר אותו DMF כדי לזרז מוצר מוצק.
  4. הידרוליזה של המוצר המוצק בחומצה טריפלואורואצטית (TFA)/H2O, 1:10 v/v (100 מ"ל) ב-90°C ויבש. הסר את הממס מתחת ל- 80 kPa כדי לקבל את מוצר הביניים הסופי, אבקה יבשה בצבע צהוב בהיר.
  5. ממיסים את מוצר הביניים (7.4 גרם, 23.8 מילימול, 1.0 eq.) בטטרהידרופורן (THF)/אתנול, 1:1 v/v (100 מ"ל). לאחר מכן הוסף 1.43 גרם של NaBH4 (35.7 mM, 1.5 eq.) לאט ב 0 ° C. לאחר 3 שעות, הסר את כל הממסים תחת ואקום והשהה את השאריות בתמיסת מים ודיכלורומתאן ביחס 1:1 (50 מ"ל כל אחד).
  6. הכינו דיכלורומתאן כדי לחלץ את המוצר מהשכבה המימית. מסירים את השכבה האורגנית ומייבשים מעל מגנזיום גופרתי.
  7. לטהר את המוצר הגולמי על ידי כרומטוגרפיה של עמודי ג'ל סיליקה באמצעות DCM/MeOH ביחס של 10:1 (1% TEA). לבסוף, להשיג 5.31 גרם (18.6 mM, 78.3%) של אבקה צהבהב טהור יחסית NB-COOH.

3. סינתזה של ג'לטין-NB

  1. הכינו 5 גרם של ג'לטין עבור אצווה אחת של שינוי. הכן תמיסת ג'לטין הומוגנית על ידי המסת 5 גרם של ג'לטין ב 100 מ"ל של מים deionized ולאחסן ב 37 ° C.
    הערה: כאן, המקורי 33 x 10-5 שומות ε-קבוצות אמינו / g ג'לטין11 מוגדר.
  2. הגדר את יחס ההזנה (FR) כיחס המולרי בין קבוצות NB וקבוצות אמינו ראשוניות בג'לטין. במחקר זה, 53 מ"ג של NB עם 1 גרם של ג'לטין הוגדר FRNB = 1.
  3. יש להמיס 1,060 מ"ג של NB-COOH ב-5 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי להפעיל את קבוצות הקרבוקסיל של NB-COOH. מכיוון שקבוצת NB רגישה לאור אולטרה סגול (UV) כאשר היא בתמיסה, תמיד יש להרחיק אותה מאור.
  4. הוסיפו 746 מ"ג של 1-(3-דימתילאמינופרופיל)-3-אתילקרבודימיד הידרוכלוריד (EDC) לתמיסת NB-COOH DMSO וערבבו במשך 5 דקות. לאחר המסת EDC, יש להוסיף 448 מ"ג של N-הידרוקסיסוקסינימיד (NHS) ולערבב במשך 5 דקות.
  5. השתמשו במשפך טיפה כדי לזרוק באיטיות את התערובת בקצב של 0.5 מ"ל/דקה לתוך תמיסת הג'לטין המומס תוך ערבוב נמרץ כדי להגיב ב-45°C במשך 4 שעות.

4. טיהור ואחסון המוצר

  1. דיאליזה של תמיסת הג'לטין-NB כנגד עודפי מים שעברו דה-יוניזציה למשך 3 ימים לפחות, ולאחר מכן לאסוף, להקפיא וליופיליזציה כדי להשיג את קצפי הג'לטין-NB. יש לשמור את הקצף במייבש בחושך לשימוש נוסף.
  2. יש להמיס את קצפי הג'לטין-NB המיובשים בהקפאה במים נטולי יונים, בטמפרטורה של 37°C, מיד לפני השימוש.

תוצאות

איור 2A מראה סכמה של התגובות הכימיות העיקריות המעורבות בסינתזה של ג'לטין-NB, אשר מקדם אינטגרציה של רקמות על-ידי השתלת קבוצות NB על ג'לטין. איור 2B מראה שה-O-nitrobenzene של הידרוג'ל הג'לטין-NB הופך לקבוצת NB מיד לאחר הקרנת UV, ואז ניתן להצליב את קבוצת האלדהיד הפעילה עם קבוצת...

Discussion

חומרי דבק הם סוג חדש של חומר. יותר ויותר חוקרים מחויבים לסינתזה של חומרי דבק מסוגים שונים, ומנסים למצוא את יישומם בביוטכנולוגיה, הנדסת רקמות, רפואה רגנרטיבית ותחומים נוספים, מה שהוביל לפיתוח נמרץ בשנים האחרונות. בנוסף להתמקדות בהדבקה חזקה של חומרי דבק, החוקרים גם מקדישים תשומת לב רבה יותר ?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

ללא.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC)AladdinL287553
4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehydeShanghai Acmec Biochemical Co., LtdH946072
DCMAladdinD154840
DichloromethaneSigma-Aldrich270997
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich20-139
dimethylformamide (DMF)Sigma-AldrichPHR1553
gelatinSigma-Aldrich1288485
magnesium sulfateSigma-AldrichM7506
MeOHSigma-Aldrich1424109
methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl esterchemsrc141333-27-9
methyl 4-bromobutyrateAladdinM158832
NaBH4Sigma-Aldrich215511
N-hydroxysuccinimide (NHS)AladdinD342712
nitric acidSigma-Aldrich225711
potassium carbonateSigma-Aldrich209619
SEM (Nova Nano 450)Thermo FEI17024560
THF/EtOHAladdinD380010
trifluoroacetic acid (TFA)Sigma-Aldrich8.0826

References

  1. Tam, R. Y., Smith, L. J., Shoichet, M. S. Engineering cellular microenvironments with photo- and enzymatically responsive hydrogels: toward biomimetic 3D cell culture models. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 703-713 (2017).
  2. Xu, X., et al. Bioadhesive hydrogels demonstrating pH-independent and ultrafast gelation promote gastric ulcer healing in pigs. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
  3. Zheng, J., et al. Directed self-assembly of herbal small molecules into sustained release hydrogels for treating neural inflammation. Nature Communications. 10 (1), 1604 (2019).
  4. Seif-Naraghi, S. B., et al. Safety and efficacy of an injectable extracellular matrix hydrogel for treating myocardial infarction. Science Translational Medicine. 5 (173), (2013).
  5. Mao, Q., et al. GelNB molecular coating as a biophysical barrier to isolate intestinal irritating metabolites and regulate intestinal microbial homeostasis in the treatment of inflammatory bowel disease. Bioactive Materials. 19, 251-267 (2022).
  6. Nan, J., et al. A highly elastic and fatigue-resistant natural protein-reinforced hydrogel electrolyte for reversible-compressible quasi-solid-state supercapacitors. Advanced Science. 7 (14), 2000587 (2020).
  7. Matsumoto, K., Sakikawa, N., Miyata, T. Thermo-responsive gels that absorb moisture and ooze water. Nature Communications. 9 (1), 2315 (2018).
  8. Liu, R., et al. resilient, adhesive, and anti-freezing hydrogels cross-linked with a macromolecular cross-linker for wearable strain sensors. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (35), 42052-42062 (2021).
  9. Hong, Y., et al. A strongly adhesive hemostatic hydrogel for the repair of arterial and heart bleeds. Nature Communications. 10 (1), 2060 (2019).
  10. Yang, Y., et al. Tissue-integratable and biocompatible photogelation by the imine crosslinking reaction. Advanced Materials. 28 (14), 2724-2730 (2016).
  11. Ofner, C. M., Bubnis, W. A. Chemical and swelling evaluations of amino group crosslinking in gelatin and modified gelatin matrices. Pharmaceutical Research. 13 (12), 1821-1827 (1996).
  12. Zhang, Y., et al. A long-term retaining molecular coating for corneal regeneration. Bioactive Materials. 6 (12), 4447-4454 (2021).
  13. Liang, Y., Li, Z., Huang, Y., Yu, R., Guo, B. Dual-dynamic-bond cross-linked antibacterial adhesive hydrogel sealants with on-demand removability for post-wound-closure and infected wound healing. ACS Nano. 15 (4), 7078-7093 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

189o nitrosobenzaldehydebiosynthetic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved