إنشاء نموذج شفاء تجويف استخراج ضرس الفك السفلي

Summary

يوضح هذا البروتوكول تفاصيل خطوة بخطوة حول كيفية استخراج الضرس الأول للفك السفلي في الماوس. يوفر طريقة بديلة للباحثين الذين يركزون على شفاء عظم الفك وتجديده.

Abstract

تقدم هذه الدراسة تطوير نموذج استخراج المولي في الفك السفلي للفأر لتوفير نموذج عملي لدراسة تجديد العظام السنخية والتعظم داخل الغشاء. تم استخدام الفئران C57 / J6 لاستخراج الضرس الأول للفك السفلي لإنشاء هذا النموذج. تم القتل الرحيم ، وحصاد الفك السفلي الثنائي ، في 1 أسبوع و 4 أسابيع بعد الجراحة ، على التوالي. تم إجراء الحصاد المجسم التسلسلي اللاحق ، والتقييم النسيجي ، وتلطيخ التألق المناعي لإثبات نجاح الجراحة. مباشرة بعد الجراحة ، عرضت الصور المجسمة مقبس استخراج فارغ. أظهر الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E & E) في 1 أسبوع وتلطيخ ماسون في 4 أسابيع بعد الجراحة أن منطقة الجذر الأصلي كانت مملوءة جزئيا وكليا بالترابيق العظمي ، على التوالي. أظهر تلطيخ التألق المناعي أنه بالمقارنة مع جانب التوازن ، زاد تعبير Sp7 في 1 أسبوع بعد الجراحة ، مما يشير إلى تكوين عظمي قوي في الحفرة السنخية. أظهرت كل هذه النتائج نموذجا عمليا لشفاء مقبس قلع أسنان الفئران. يمكن للدراسات القادمة التي تكشف عن آليات التئام عيوب عظم الفك أو التئام التجويف أن تتبنى هذه الطريقة.

Introduction

يعد التئام التجويف بعد قلع الأسنان سيناريو سريريا شائعا ، والذي يمكن أن يؤدي إلى مضاعفات غير لائقة مثل نزيف التجويف أو السنخ الجاف أو حتى التهاب العظم والنقي في الفك تحت الشفاء غير المرغوب فيه¹،^2،3. قد تضعف هذه الأمراض المصاحبة نوعية حياة المرضى ، والأسوأ من ذلك ، أنها تتحدى بشكل حيوي إعادة التأهيل الاصطناعي بسبب فقدان العظام الهائل⁴. على الرغم من توضيح مراحل شفاء التجويف ، إلا أنها غير كافية لتوجيه الرعاية السريرية بعد جراحة قلع الأسنان عند مواجهة تحديات التشخيص المختلفة⁴.

تم إجراء دراسات متعددة تستند إلى نماذج حيوانية لاكتساب فهم أفضل للآليات الأساسية في عملية شفاء التجويف وتجنب المواقف المذكورة أعلاه. Sp7 هو منظم رئيسي في تمايز بانيات العظم ، ويلعب دورا حيويا في نمو الهيكل العظمي ، وإرقاء العظام ، وتجديد العظام ^5,6. يمكن أن تعرض نماذج الشفاء العقلاني التجويف تكرار Sp7 بعد الصدمة في تجديد العظام. بالإضافة إلى ذلك ، بخلاف التئام كسور العظام الطويلة ، فإن عملية عظمية واحدة فقط ، التعظم داخل الغشاء ، تتضمن عملية الشفاء من مقبس الاستخراج⁷. هذا يجعل نموذج قلع الأسنان الحيوانية مثاليا لدراسة العلاجات القائمة على الزرع ، حيث أن الاندماج العظمي للزرع يطيع نفس القاعدة^{العظمية 8}.

لعقود من الزمان ، تم إجراء نموذج قلع الأسنان في الفئران والأرانب والكلاب ، لأن هذه الأنواع لها أسنان كبيرة ملائمة للعمل على⁹،^10،11. ومع ذلك ، نظرا للمطالب المزدهرة للتعديل الوراثي وكخلفية وراثية أكثر تكيفا مع البشر ، يتم استخدام الفئران بشكل متزايد لإنشاء نموذج قلع الأسنان. من الآن فصاعدا ، يمكن للباحثين الكشف عن دور مجموعة خلايا معينة في عملية شفاء المقبس باستخدام الفئران المعدلة بالجينوم بدلا من مراقبة الأنماط الظاهرية¹² فقط. من بين نماذج مقبس قلع أسنان الفئران ، أظهرت الدراسات السابقة عملية إنشاء وشفاء أسنان الفئران الفكية ومآخذ قلع القواطع^{القاطعة 13}،¹⁴،^15،16. ومع ذلك ، قد يختلف نمط الشفاء من التشخيص ، والنقاط الزمنية المخبرية والملاحظة ، عبر البروتوكولات. هذا يناشد معيارا عالميا للعلماء لإنشاء نموذج شفاء تجويف الفئران.

تهدف هذه الدراسة إلى تشكيل نموذج عملي لشفاء تجويف الفئران للقضايا المذكورة أعلاه. تتميز أضراس الفك السفلي في الفئران بسمات مورفولوجية مميزة مقارنة بأضراس الفك العلوي والقواطع ، مما يجلب مزايا وعيوب فريدة. نظرا لأن النماذج التي تركز على الفك السفلي للفأر تعتمد حاليا على الفراغ ، فقد حاول هذا البروتوكول توفير طريقة بارعة لاستخراج الضرس الأول للفك السفلي في الفئران. نأمل أن ينير هذا البروتوكول الباحثين الأساسيين بأفكار جديدة للكشف عن الآليات الأساسية لشفاء المقبس والإشارة إلى الرعاية السريرية.

Protocol

تمت مراجعة جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية لمدرسة غرب الصين لطب الأسنان ، جامعة سيتشوان (WCHSIRB-D-2017-041). تم استخدام الفئران البالغة C57BL / 6 ، التي تم الحصول عليها من مصدر تجاري (انظر جدول المواد) ، في هذه الدراسة.

1. التحضير قبل الجراحة

1. إعداد الصك
   1. قم بإعداد إبر مختلفة من المحاقن التي تستخدم لمرة واحدة (26G ، 25G ، 23G ؛ انظر جدول المواد) لاستخدامها كمصاعد. قم بتحويل رأس الإبرة حوالي 20 درجة -40 درجة ، كما هو موضح في الشكل 1.
   2. تحضير ملاقط العيون المسننة كملقط. تأكد من أنه يناسب حجم أضراس الفئران ويمكنه الإمساك بالأضراس بإحكام. يظهر حجم الملقط المثالي في الشكل 1A ، B3.
   3. احصل على شريط مطاطي (يمكن تمزيقه من قفاز اللاتكس الطبي) لاستخدامه كفتاحة فم ، ولوح رغوة أو لوح فلين كمنصة جراحية ، ومصباح أمامي لإضاءة منطقة الجراحة ، ووسادة تدفئة لإحياء ما بعد الجراحة. قم بتمزيق كرة قطنية جافة إلى قطع صغيرة وضعها على موقع الجراحة في حالة حدوث نزيف أثناء العملية.
2. إعداد التخدير
   1. يمكن تخدير الفأر بأي بروتوكول مخدر مناسب يحقق تخديرا عاما مؤكدا من خلال طريقة "قرصة إصبع القدم". بعد التخدير ، ضع مرهما بيطريا على عيون الماوس.
      ملاحظة: يمكن أن يكون بروتوكول التخدير العام المفضل هو: الحث والصيانة مع زيلازين (10 ملغم / كغم) والكيتامين (100 ملغم / كغم) داخل الصفاق (IP) ؛
      في هذه الدراسة ، تم استخدام إيزوفلوران و 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم (50 مجم / كجم ، IP) لتحريض التخدير والصيانة بجرعات إضافية حسب الحاجة.
3. إعداد التطهير والتعقيم
   1. قم بتطهير منصة التشغيل والنفقات العامة في الهواء الطلق باستخدام بخاخ إيثانول بنسبة 75٪. قبل كل إجراء للماوس ، يوصى باستخدام مجموعة جديدة من الإبر التي تستخدم لمرة واحدة.
      ملاحظة: الملقط المسنن قابل لإعادة الاستخدام ويمكن تعقيمه باستخدام أي طريقة مفضلة مثل التعقيم بالبخار.

2. العملية الجراحية

1. تثبيت الفأر والفك السفلي
   1. اربط الماوس بمنصة جراحية في وضع ضعيف باستخدام شريط لاصق. قم بتثبيت إبرتين 26 G بما يتماشى مع مستوى الأذن المدارية وإبرتين أخريين 26 G بسهولة أسفل الفك السفلي.
   2. ضع الشريط المطاطي حول الإبر واعبر القواطع لإبقاء الفم مفتوحا. اسحب اللسان قليلا للخارج وقم بتثبيته تحت الشريط المطاطي المقابل للجانب الجراحي ، لمنعه من إعاقة مجال الرؤية (الشكل 1C).
2. القضاء على المقاومة البعيدة
   1. امسك الضرس بملاقط متوسطة ، وادفع إبرة 23 جم في العظم السنخي الشدقي للجذر البعيد ، وقم بعمل فاصل زمني.
      ملاحظة: يجب اتخاذ هذه الخطوة بحذر شديد ، لأن الإبرة المضمنة بعمق كبير من المحتمل أن تقطع الجذر.
   2. بعد ذلك ، قم بالتغيير إلى إبرة 25 G لمواصلة توسيع الفاصل الزمني ، والتقدم بدقة نحو المنطقة المحيطة بالذروة مع تدوير الإبرة ببطء للأمام ولغويا (مع الوضع التشريحي للفأر) للضغط على الجذر خارج الحفرة السنخية.
3. القضاء على المقاومة المتوسطة
   1. عندما يكون هناك مساحة كافية ، استخدم إبرة 23 G لإدخالها في شوكة الجذر ورفع الضرس بشكل إطباقي. بعد إمساك الضرس بإحكام ، خذ إبرة 23 G أخرى واجبرها على الدخول في الغشاء اللثوي المتوسط اللساني لإنشاء فاصل زمني.
   2. ثم استبدلها بإبرة 25 جم وقم بتدويرها ببطء للأمام والشدق. إذا كانت بعض العوائق الأساسية تعيق خلع الضرس ، فاستخدم إبرة 26 جم لاختراق قمة الجذر ، وكرر العمليات.
4. الاستخراج النهائي
   1. قلع السن ، وأثناء الاستخراج ، تأكد من أن التاج يرتفع عاليا فوق المستوى الإطباقي وأنه يمكن رؤية جذرين سليمين بوضوح.
      ملاحظة: يعتبر خلع (خلع) السن أكثر اللحظات إيلاما وحزنا في العملية. قبل خلع السن ، يجب إعادة تقييم عمق التخدير باستخدام اختبار قرصة إصبع القدم ، وبالتالي ، يجب إعطاء جرعة معتدلة من عامل مخدر إذا لزم الأمر.
5. رعاية ما بعد الجراحة
   1. بعد خلع السن ، ضع قطنا جافا لوقف النزيف ، وأعد وضع اللسان ، وتطبيق كاربروفين (5 مجم / كجم) تحت الجلد ، وضع الماوس على وسادة تسخين بدرجة حرارة ثابتة حتى الشفاء من التخدير.

3. تصوير الفك السفلي للفأر ومقبس الاستخراج

1. تحضير العينات
   1. القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم. استخدم مقص العيون لقطع عضلات الهيكل العظمي المرتبطة بالفك السفلي والقوس الوجني. قطع من الحلق على طول الحافة السفلية للفك السفلي إلى الفرع الصاعد ثم إلى الجانب الخلفي من اللقمة ، ثم اسحب الفك السفلي لأسفل واقطع على طول خط الوسط السفلي القاطعة. بهذه الطريقة ، يتم حصاد الفك السفلي المنفصلين.
   2. قم بإجراء التثبيت وإزالة المعادن والجفاف باتباع الإجراء القياسي¹⁷. عند تضمين¹⁷، تأكد من أن مستوى الإطباق مواز لحافة الدرج (انظر جدول المواد). ثبت الفك السفلي في الجزء السفلي من الكاسيت ، مع تثبيت حافته السفلية (الشكل 2).
      ملاحظة: يقدم هذا البروتوكول المستوى السهمي لمنطقة الفك السفلي.
2. تثبيت العينة على الميكروتوم
   1. قم بتنظيم مشبك العينة في الميكروتوم لإبراز اللقمة وجانب التاج 5 درجات -20 درجة أكثر ، للحصول على صورة متكاملة من لب التاج المصاحب مع لب الجذر (الشكل 2).
3. إعداد الأقسام
   ملاحظة: اللقمة هي دائما أول بنية تشريحية يتم قطعها. عندما يتلاشى ، يمكن بعد ذلك تقطيع المنطقة المولية إلى عدة شرائح.
   1. قم بتحويل نطاق الميكروتوم إلى 5 ميكرومتر ، واجمع كل ثماني شرائح ، واستكشف العاج في الشريحة الأخيرة. إذا ظهر عاج التاج لأول مرة بدون أي عاج قمي جذري ، فاضبط مشبك العينة لجعل منطقة الجذر تبرز ، والعكس صحيح.
4. جمع الأقسام
   ملاحظة: زاوية القطع مناسبة حتى يتم الوصول إلى العاج بالتساوي في كل من منطقة التاج والقمي.
   1. قطع على طول هذا الاتجاه ومشاهدة الشرائح تحت المجهر حتى يظهر لب الأسنان في كل من التاج والجذور. اجمع الأقسام عندما يظهر محيط غامض من الأضراس على سطح عينة البارافين¹⁷.

النتائج

لتوضيح الاستخدام العملي لهذه الطريقة ، تم استخراج الضرس الأول للفك السفلي الأيمن لاثنين من الفئران السليمة C57BL / 6 (3 أشهر من العمر ، كلاهما من الإناث) ومتابعته لمدة 1 أسبوع و 4 أسابيع ، على التوالي. تم استخدام الفك السفلي الأيسر غير التالف كضوابط صحية. يوضح الشكل 1 أ السمات الم?...

Discussion

يعد نموذج شفاء تجويف الفئران طريقة مهمة لكشف الآليات الأساسية في شفاء العظام وتجديدها ، مما يؤدي في النهاية إلى حل التحديات السريرية. أظهرت الدراسات الحالية إمكانية نموذج استخراج القواطع القاطعة ونموذج استخراج الضرس الفكي العلوي ، في حين لم تستخدم الدراسات نموذج الضرس الأول للفك السفلي<...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
23/25/26 G needle	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)
C57/B6J	Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China	C57/B6J
DAPI Staining Solution	Beyotime	Cat#C1005
Embedding Cassettes	CITOTEST Scientific	80106-1100-16
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Biosharp	BL700B
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22-10
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Microtome	Leica	RM2235
Pentobarbital Sodium	Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd	2018042001
Rabbit polyclonal	anti-Sp7	Abcam Cat# ab22552
Tweezers	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB2-115