El establecimiento de un modelo de curación del alvéolo de extracción molar mandibular murina

Resumen

Este protocolo muestra detalles paso a paso de cómo extraer el primer molar mandibular en el ratón. Proporciona un método alternativo para los investigadores que se centran en la curación y regeneración de la mandíbula.

Resumen

Este estudio introduce el desarrollo de un modelo de extracción molar en la mandíbula murina para proporcionar un modelo practicable para estudiar la regeneración ósea alveolar y la osificación intramembranosa. Se utilizaron ratones C57/J6 para extraer el primer molar mandibular para establecer este modelo. Fueron sacrificados, y las mandíbulas bilaterales cosechadas, a 1 semana y 4 semanas después de la cirugía, respectivamente. Se realizó posterior recolección estereoscópica seriada, evaluación histológica y tinción de inmunofluorescencia para demostrar el éxito de la cirugía. Inmediatamente después de la cirugía, las imágenes estereoscópicas mostraban un zócalo de extracción vacío. La hematoxilina y la eosina (H&E) a la semana y la tinción de Masson a las 4 semanas después de la cirugía mostraron que el área de la raíz original estaba parcial y completamente llena de trabéculas óseas, respectivamente. La tinción de inmunofluorescencia mostró que, en comparación con el lado de la homeostasis, la expresión de Sp7 aumentó a 1 semana después de la cirugía, lo que sugiere osteogénesis vigorosa en la fosa alveolar. Todos estos resultados demostraron un modelo practicable de curación del alvéolo de extracción de dientes murinos. Los próximos estudios que revelan los mecanismos de curación de defectos de la mandíbula o curación de alvéolos podrían adoptar este método.

Introducción

La cicatrización del alvéolo después de la extracción dental es un escenario clínico común, que puede resultar en complicaciones impropias como hemorragia de alvéolo, alveolitis seca o incluso osteomielitis de la mandíbula bajo curación indeseable ^1,2,3. Estas comorbilidades pueden perjudicar la calidad de vida de los pacientes y, lo que es peor, dificultar vitalmente la rehabilitación protésica debido a la pérdida ósea masiva⁴. A pesar de que las etapas de curación del alvéolo han sido dilucidadas, son inadecuadas para dirigir la atención clínica posterior a la cirugía de extracción dental cuando se encuentran con diversos desafíos pronósticos⁴.

Se han realizado múltiples estudios basados en modelos animales para obtener una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes en el proceso de curación del alvéolo y evitar las situaciones anteriores. Sp7 es un regulador maestro en la diferenciación de osteoblastos, desempeñando un papel vital en el desarrollo del esqueleto, la hemostasia ósea y la regeneración ósea ^5,6. Los modelos racionales de curación de alvéolos podrían mostrar la redundancia de Sp7 postraumático en la regeneración ósea. Además, a diferencia de la cicatrización de la fractura de huesos largos, un solo proceso osteogénico, la osificación intramembranosa, implica el proceso de curación del alvéolo de extracción⁷. Esto hace que el modelo de extracción de dientes animales sea óptimo para estudiar terapias basadas en implantes, ya que la osteointegración de implantes obedece a la misma regla osteogénica⁸.

Durante décadas, el modelo de extracción dental se ha realizado en ratas, conejos y perros, ya que estas especies tienen dientes grandes que son convenientes para operar en 9,10,11^. Sin embargo, dadas las florecientes demandas de modificación genética y como un fondo genético más adaptativo a los humanos, los ratones se utilizan cada vez más para establecer un modelo de extracción dental. A partir de entonces, los investigadores podrían desentrañar el papel de una población celular específica en el proceso de curación del alvéolo utilizando ratones modificados con genoma en lugar de observar fenotipos solo¹². Entre los modelos de alvéolo de extracción de dientes murinos, estudios previos han demostrado el establecimiento y proceso de curación de los alvéolos murinos de extracción de dientes maxilares e incisivos^13,14,15,16. Sin embargo, el patrón de curación del pronóstico, y los puntos de tiempo detective y observativos, pueden diferir entre los protocolos. Esto apela a un criterio universal para que los estudiosos establezcan un modelo murino de curación de alvéolos.

Este estudio tuvo como objetivo constituir un modelo practicable de curación de alvéolo murino para los problemas anteriores. Los molares de la mandíbula en ratones tienen rasgos morfológicos distintivos en comparación con los molares e incisivos maxilares, lo que aporta ventajas y desventajas únicas. Como los modelos que se centran en la mandíbula murina están actualmente basados en el vacío, este protocolo trató de proporcionar un método logrado para extraer el primer molar mandibular en ratones. Esperamos que este protocolo ilumine a los investigadores básicos con nuevas ideas para descubrir los mecanismos subyacentes de la curación de la cavidad e indicar la atención clínica.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales en este estudio fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de la Escuela de Estomatología de China Occidental de la Universidad de Sichuan (WCHSIRB-D-2017-041). Para el presente estudio se utilizaron ratones adultos C57BL/6, obtenidos de una fuente comercial (ver Tabla de materiales).

1. Preparación prequirúrgica

1. Preparación del instrumento
   1. Prepare varias agujas de jeringas desechables (26G, 25G, 23G; consulte la Tabla de materiales) para usarlas como elevadores. Incline la cabeza de la aguja aproximadamente 20°-40°, como se muestra en la Figura 1.
   2. Prepare pinzas oftálmicas dentadas como fórceps. Asegúrese de que se ajuste al tamaño de los molares de los ratones y pueda agarrar los molares firmemente. El tamaño ideal de pinza se muestra en la Figura 1A, B3.
   3. Obtenga una banda elástica (que se puede arrancar de un guante de látex médico) para usar como abridor bucal, una tabla de espuma o tablero de corcho como plataforma quirúrgica, un faro para iluminar el área quirúrgica y una almohadilla térmica para el renacimiento postoperatorio. Rompa una bola de algodón seca en trozos pequeños y aplíquela al sitio quirúrgico si se produce sangrado durante el procedimiento.
2. Preparación de la anestesia
   1. El ratón puede ser anestesiado por cualquier protocolo anestésico adecuado que logre la anestesia general confirmada a través del método de "pinzamiento del dedo del pie". Después de la anestesia, aplique ungüento veterinario en los ojos del ratón.
      NOTA: El protocolo anestésico general preferido podría ser: inducción y mantenimiento con xilazina (10 mg/kg) y ketamina (100 mg/kg) por vía intraperitoneal (IP);
      Para este estudio, se utilizó isoflurano y pentobarbital sódico al 1% (50 mg/kg, IP) para la inducción y mantenimiento de la anestesia con dosis adicionales según sea necesario.
3. Preparación para la desinfección y esterilización
   1. Desinfecte la plataforma de operación y la parte superior al aire libre con un pulverizador de etanol al 75%. Antes de cada procedimiento con ratón, se recomienda el uso de un nuevo juego de agujas desechables.
      NOTA: Las pinzas dentadas son reutilizables y se pueden esterilizar utilizando cualquier método preferido, como la esterilización por vapor.

2. Proceso quirúrgico

1. Fijación del ratón y su mandíbula
   1. Ate el ratón a una plataforma quirúrgica en posición supina con cinta adhesiva. Fije dos agujas de 26 G en línea con el plano orbital de la oreja y otras dos agujas de 26 G a gusto debajo de la mandíbula.
   2. Aplique la banda elástica alrededor de las agujas y cruce los incisivos para mantener la boca abierta. Tire ligeramente de la lengua y fíjela debajo de la banda elástica opuesta al lado quirúrgico, para evitar que obstruya el campo de visión (Figura 1C).
2. Eliminación de la resistencia distal
   1. Sostenga el molar con pinzas mesialmente, fuerce una aguja de 23 G en el hueso alveolar bucal de la raíz distal y produzca un intervalo.
      NOTA: Este paso debe tomarse con gran precaución, ya que una aguja que está incrustada demasiado profundo probablemente romperá la raíz.
   2. A continuación, cambie a una aguja de 25 G para continuar expandiendo el intervalo y progrese delicadamente hacia el área periapical mientras gira lentamente la aguja hacia adelante y lingualmente (con la posición anatómica del ratón) para presionar la raíz fuera de la fosa alveolar.
3. Eliminación de la resistencia mesial
   1. Cuando haya suficiente espacio, use una aguja de 23 G para insertar en el tenedor de la raíz y levante el molar oclusalmente. Después de sostener el molar con fuerza, tome otra aguja de 23 G y fuércela a entrar en la membrana periodontal mesial lingual para crear un intervalo.
   2. Luego, sustituya con una aguja de 25 G y gire lentamente hacia adelante y por vía bucal. Si algunos obstáculos subyacentes impiden la luxación del molar, use una aguja de 26 G para penetrar el ápice de la raíz y repita las operaciones.
4. Extracción final
   1. Extraiga el diente y, durante la extracción, asegúrese de que la corona se eleve por encima del plano oclusal y que se puedan ver claramente dos raíces intactas.
      NOTA: La luxación (dislocación) del diente se considera el momento más doloroso y angustiante del procedimiento. Antes de dislocar el diente, la profundidad anestésica debe reevaluarse mediante la prueba de pellizco del dedo del pie y, en consecuencia, se debe administrar una dosis moderada de un agente anestésico si es necesario.
5. Cuidados postoperatorios
   1. Después de extraer el diente, aplique algodón seco para detener el sangrado, reposicione la lengua, administre carprofeno (5 mg / kg) por vía subcutánea y coloque el mouse en una almohadilla térmica a temperatura constante hasta la recuperación de la anestesia.

3. Imágenes de la mandíbula del ratón y el zócalo de extracción

1. Preparación de las muestras
   1. Eutanasia al ratón por luxación cervical. Use tijeras oftálmicas para cortar los músculos del esqueleto unidos a la mandíbula y al arco cigomático. Corte desde la garganta a lo largo del borde inferior de la mandíbula hasta la rama ascendente y luego hasta la parte posterior del cóndilo, y luego tire de la mandíbula hacia abajo y corte a lo largo de la línea media del incisivo inferior. De esta manera, se cosechan las dos mandíbulas separadas.
   2. Realizar la fijación, desmineralización y deshidratación siguiendo el procedimiento estándar¹⁷. Al incrustar¹⁷, asegúrese de que el plano oclusal esté paralelo al borde del casete (consulte la Tabla de materiales). Fije la mandíbula en la parte inferior del casete, con su borde inferior ladeado (Figura 2).
      NOTA: Este protocolo ofrece el plano sagital del área de la mandíbula.
2. Fijación de la muestra en el micrótomo
   1. Regular la pinza de la muestra en el micrótomo para que sobresalga el cóndilo y el lado de la corona 5°-20° más, para lograr una imagen integrada de la pulpa de la corona concomitante con la pulpa de la raíz (Figura 2).
3. Preparación de las secciones
   NOTA: El cóndilo es siempre la primera estructura anatómica en ser cortada. Cuando se desvanece, el área molar se puede cortar en varias rodajas.
   1. Cambie el rango de microtomo a 5 μm, recoja cada ocho rebanadas y busque dentina en la última rebanada. Si la dentina de la corona aparece por primera vez sin dentina apical de la raíz, ajuste la pinza de la muestra para que el área de la raíz sobresalga, y viceversa.
4. Recopilación de las secciones
   NOTA: El ángulo de corte es apropiado hasta que la dentina se alcanza por igual tanto en la corona como en el área apical.
   1. Corte en esta dirección y observe las rodajas bajo el microscopio hasta que aparezca la pulpa dental tanto en la corona como en las raíces. Recoger las secciones cuando aparezca un contorno oscuro de molares en la superficie de la muestra de parafina¹⁷.

Resultados

Para dilucidar el uso práctico de este método, se extrajo el primer molar mandibular derecho de dos ratones sanos C57BL/6 (3 meses de edad, ambas hembras) y se les siguió durante 1 semana y 4 semanas, respectivamente. Las mandíbulas izquierdas no dañadas se utilizaron como controles sanos. La Figura 1A muestra las características específicas del aparato quirúrgico, incluyendo agujas 26-23 G y una pinza oftálmica dentada. La aguja de 26 G se retira y dobla. La aguja de 25 G se dobla ...

Discusión

El modelo de curación de la cavidad murina es un método importante para desentrañar los mecanismos subyacentes en la curación y regeneración ósea, resolviendo en última instancia los desafíos clínicos. Estudios existentes han demostrado la posibilidad del modelo de extracción incisiva y del modelo de extracción de molar maxilar, mientras que los estudios no han utilizado el modelo de primer molar mandibular^13,17,18. S...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
23/25/26 G needle	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)
C57/B6J	Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China	C57/B6J
DAPI Staining Solution	Beyotime	Cat#C1005
Embedding Cassettes	CITOTEST Scientific	80106-1100-16
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Biosharp	BL700B
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22-10
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Microtome	Leica	RM2235
Pentobarbital Sodium	Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd	2018042001
Rabbit polyclonal	anti-Sp7	Abcam Cat# ab22552
Tweezers	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB2-115