Die Etablierung eines murinen murinen molaren Extraktionsalveolen-Heilungsmodells

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt Schritt für Schritt, wie der erste Backenzahn des Unterkiefers in der Maus extrahiert wird. Es bietet eine alternative Methode für Forscher, die sich auf die Heilung und Regeneration von Kieferknochen konzentrieren.

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird die Entwicklung eines molaren Extraktionsmodells im murinen Unterkiefer vorgestellt, um ein praktikables Modell für die Untersuchung der alveolären Knochenregeneration und der intramembranösen Ossifikation bereitzustellen. C57/J6-Mäuse wurden verwendet, um den ersten Backenzahn des Unterkiefers zu extrahieren, um dieses Modell zu etablieren. Sie wurden 1 Woche bzw. 4 Wochen nach der Operation euthanasiert und die beidseitigen Mandibeln entnommen. Anschließend wurden eine serielle stereoskopische Ernte, eine histologische Beurteilung und eine Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt, um den Erfolg der Operation nachzuweisen. Unmittelbar nach der Operation zeigten die stereoskopischen Bilder eine leere Extraktionsalveole. Die Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E) nach 1 Woche und die Masson-Färbung nach 4 Wochen nach der Operation zeigten, dass der Bereich der ursprünglichen Wurzel teilweise bzw. vollständig mit Knochentrabekeln gefüllt war. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass die Sp7-Expression im Vergleich zur Homöostaseseite 1 Woche postoperativ zunahm, was auf eine starke Osteogenese in der Alveolargrube hindeutet. Alle diese Ergebnisse zeigten ein praktikables Modell für die Heilung der Zahnextraktionsalveole bei Mäusen. Kommende Studien, die die Mechanismen der Heilung von Kieferknochendefekten oder -pfannen aufdecken, könnten diese Methode übernehmen.

Einleitung

Die Heilung der Alveole nach einer Zahnextraktion ist ein häufiges klinisches Szenario, das bei unerwünschter Heilung zu unerwünschten Komplikationen wie Alveolenblutungen, trockener Alveole oder sogar Kieferosteomyelitis führen kann ^1,2,3. Diese Komorbiditäten können die Lebensqualität der Patienten beeinträchtigen und, schlimmer noch, die prothetische Rehabilitation aufgrund des massiven Knochenschwunds erheblich erschweren⁴. Obwohl die Heilungsstadien der Alveole aufgeklärt wurden, sind sie nicht ausreichend, um die klinische Versorgung nach einer Zahnextraktionsoperation zu leiten, wenn sie auf verschiedene Prognoseherausforderungen stoßen⁴.

Es wurden mehrere Studien auf der Grundlage von Tiermodellen durchgeführt, um ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen im Heilungsprozess der Alveole zu erlangen und die oben genannten Situationen abzuwenden. Sp7 ist ein Hauptregulator bei der Differenzierung von Osteoblasten und spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Skeletts, der Knochenhämostase und der Knochenregeneration ^5,6. Rationale Alveolenheilungsmodelle könnten die Redundanz von Sp7 posttraumatisch in der Knochenregeneration aufzeigen. Darüber hinaus umfasst im Unterschied zur Heilung von Röhrenknochenbrüchen nur ein einziger osteogener Prozess, die intramembranöse Ossifikation, den Heilungsprozess der Extraktionsalveole⁷. Dies macht das Tierzahnextraktionsmodell optimal für die Untersuchung implantatbasierter Therapien, da die Implantat-Osseointegration der gleichen osteogenen Regel⁸ gehorcht.

Jahrzehntelang wurde das Zahnextraktionsmodell bei Ratten, Kaninchen und Hunden durchgeführt, da diese Arten große Zähne haben, die bequem zu operieren sind 9,10,11. Angesichts der florierenden Nachfrage nach genetischer Modifikation und als anpassungsfähigerer genetischer Hintergrund für den Menschen werden Mäuse jedoch zunehmend verwendet, um ein Zahnextraktionsmodell zu etablieren. Von da an konnten die Forscher die Rolle einer bestimmten Zellpopulation im Heilungsprozess der Alveole anhand genommodifizierter Mäuse entschlüsseln, anstatt nur Phänotypen zu beobachten¹². Unter den Maus-Zahnextraktionsalveolenmodellen haben frühere Studien die Etablierung und den Heilungsprozess von murinen Oberkieferzahn- und Schneidezahnextraktionsalveolen^{gezeigt 13,14,15,16}. Das Heilungsmuster der Prognose und die detektiven und beobachtenden Zeitpunkte können sich jedoch je nach Protokoll unterscheiden. Dies appelliert an ein universelles Kriterium für Wissenschaftler, um ein Modell für die Heilung von Mausfä�ollen zu etablieren.

Ziel dieser Studie war es, ein praktikables Modell für die Heilung der Mausalveole für die oben genannten Probleme zu entwickeln. Unterkiefermolaren bei Mäusen haben im Vergleich zu Oberkiefermolaren und Schneidezähnen unterschiedliche morphologische Merkmale, die einzigartige Vor- und Nachteile mit sich bringen. Da die Modelle, die sich auf den murinen Unterkiefer konzentrieren, derzeit vakuumbasiert sind, wurde mit diesem Protokoll versucht, eine gelungene Methode zur Extraktion des ersten Unterkieferbackenzahns bei Mäusen bereitzustellen. Wir hoffen, dass dieses Protokoll Grundlagenforscher mit neuen Ideen aufklären wird, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Alveolenheilung aufzudecken und eine klinische Behandlung anzuzeigen.

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Protokoll

Alle Tierverfahren in dieser Studie wurden von der Ethikkommission der West China School of Stomatology der Universität Sichuan geprüft und genehmigt (WCHSIRB-D-2017-041). Für die vorliegende Studie wurden adulte C57BL/6-Mäuse verwendet, die aus einer kommerziellen Quelle stammen (siehe Materialtabelle).

1. Präoperative Vorbereitung

1. Vorbereitung des Instruments
   1. Bereiten Sie verschiedene Nadeln von Einwegspritzen (26G, 25G, 23G; siehe Materialtabelle) vor, die als Aufzüge verwendet werden können. Biegen Sie den Nadelkopf um ca. 20°-40° ein, wie in Abbildung 1 gezeigt.
   2. Bereiten Sie eine gezahnte Augenpinzette als Pinzette vor. Achten Sie darauf, dass es der Größe der Backenzähne der Mäuse entspricht und die Backenzähne fest greifen kann. Die ideale Pinzettengröße ist in Abbildung 1A, B3 dargestellt.
   3. Besorgen Sie sich ein Gummiband (das von einem medizinischen Latexhandschuh abgerissen werden kann), das als Mundöffner verwendet werden kann, ein Schaumstoffbrett oder eine Korkplatte als chirurgische Plattform, eine Stirnlampe, um den Operationsbereich zu beleuchten, und ein Heizkissen für die postoperative Wiederbelebung. Zerreißen Sie einen trockenen Wattebausch in kleine Stücke und legen Sie ihn auf die Operationsstelle, wenn während des Eingriffs Blutungen auftreten.
2. Vorbereitung der Anästhesie
   1. Die Maus kann mit jedem geeigneten Anästhesieprotokoll betäubt werden, das eine Vollnarkose erreicht, die durch die "Zehenkneifmethode" bestätigt wird. Tragen Sie nach der Narkose tierärztliche Salbe auf die Augen der Maus auf.
      HINWEIS: Bevorzugtes Vollnarkoseprotokoll könnte sein: Induktion und Aufrechterhaltung mit Xylazin (10 mg/kg) und Ketamin (100 mg/kg) intraperitoneal (IP);
      Für diese Studie wurden Isofluran und 1 % Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg, IP) für die Anästhesieeinleitung und -erhaltung mit zusätzlichen Dosen nach Bedarf verwendet.
3. Desinfektions- und Sterilisationsvorbereitung
   1. Desinfizieren Sie die Arbeitsbühne und den Open-Air-Overhead mit einem Sprühgerät mit 75 % Ethanol. Vor jedem Eingriff mit der Maus wird die Verwendung eines neuen Satzes Einwegnadeln empfohlen.
      Anmerkungen: Die gezahnte Pinzette ist wiederverwendbar und kann mit jeder bevorzugten Methode wie Dampfsterilisation sterilisiert werden.

2. Chirurgischer Ablauf

1. Fixierung der Maus und ihres Unterkiefers
   1. Binden Sie die Maus in Rückenlage mit Klebeband an eine chirurgische Plattform. Stecken Sie zwei 26-G-Nadeln in einer Linie mit der Orbita-Ohrebene und zwei weitere 26-G-Nadeln bequem unterhalb des Unterkiefers.
   2. Legen Sie das Gummiband um die Nadeln und kreuzen Sie die Schneidezähne, um den Mund offen zu halten. Ziehen Sie die Zunge leicht heraus und fixieren Sie sie unter dem Gummiband gegenüber der chirurgischen Seite, um zu verhindern, dass sie das Sichtfeld behindert (Abbildung 1C).
2. Beseitigung des distalen Widerstands
   1. Halten Sie den Backenzahn mit einer Pinzette mesial, drücken Sie eine 23-G-Nadel in den bukkalen Alveolarknochen der distalen Wurzel und machen Sie ein Intervall.
      HINWEIS: Dieser Schritt muss mit großer Vorsicht unternommen werden, da eine zu tief eingebettete Nadel wahrscheinlich die Wurzel bricht.
   2. Wechseln Sie dann zu einer 25-G-Nadel , um das Intervall weiter auszudehnen, und bewegen Sie sich vorsichtig in Richtung des periapikalen Bereichs, während Sie die Nadel langsam vorwärts und lingual (mit der anatomischen Position der Maus) drehen, um die Wurzel aus der Alveolargrube zu drücken.
3. Beseitigung des mesialen Widerstands
   1. Wenn genügend Platz vorhanden ist, führen Sie eine 23-G-Nadel in die Wurzelgabel ein und heben Sie den Backenzahn okklusal an. Nachdem Sie den Backenzahn fest gehalten haben, nehmen Sie eine weitere 23-G-Nadel und drücken Sie sie in die linguale mesiale Parodontalmembran, um ein Intervall zu schaffen.
   2. Dann mit einer 25-G-Nadel ersetzen und langsam nach vorne und bukkal drehen. Wenn einige darunter liegende Hindernisse die Luxation des Backenzahns behindern, verwenden Sie eine 26-G-Nadel, um in die Wurzelspitze einzudringen, und wiederholen Sie die Operationen.
4. Abschließende Extraktion
   1. Ziehen Sie den Zahn heraus und achten Sie beim Ziehen darauf, dass die Krone hoch über die Okklusionsebene hinausragt und zwei intakte Wurzeln deutlich zu sehen sind.
      HINWEIS: Die Luxation (Luxation) des Zahns gilt als der schmerzhafteste und belastendste Moment des Eingriffs. Vor der Luxation des Zahnes sollte die Narkosetiefe mit dem Zehenquetschtest neu beurteilt und gegebenenfalls eine moderate Dosis eines Anästhetikums verabreicht werden.
5. Nachsorge
   1. Tragen Sie nach dem Ziehen des Zahns trockene Watte auf, um die Blutung zu stoppen, positionieren Sie die Zunge neu, verabreichen Sie Carprofen (5 mg/kg) subkutan und legen Sie die Maus auf ein Heizkissen mit konstanter Temperatur, bis Sie sich von der Narkose erholt haben.

3. Bildgebung des Unterkiefers der Maus und der Extraktionsalveole

1. Vorbereitung der Proben
   1. Euthanasieren Sie die Maus durch Zervixluxation. Verwenden Sie eine Augenschere, um die Skelettmuskeln zu durchtrennen, die am Unterkiefer und am Jochbogen befestigt sind. Schneiden Sie von der Kehle entlang der Unterkante des Unterkiefers bis zum aufsteigenden Ast und dann bis zur Rückseite des Kondylus, ziehen Sie dann den Unterkiefer nach unten und schneiden Sie entlang der Mittellinie des unteren Schneidezähnels. Auf diese Weise werden die beiden getrennten Mandibeln entnommen.
   2. Führen Sie die Fixierung, Demineralisierung und Dehydrierung gemäß dem Standardverfahren¹⁷ durch. Beim Einbetten¹⁷ ist darauf zu achten, dass die Okklusionsebene parallel zum Rand der Kassette verläuft (siehe Materialtabelle). Fixieren Sie den Unterkiefer an der Unterseite der Kassette, wobei die Unterkante gespannt ist (Abbildung 2).
      HINWEIS: Dieses Protokoll bietet die sagittale Ebene des Unterkieferbereichs.
2. Fixieren der Probe auf dem Mikrotom
   1. Regulieren Sie die Probenklemme im Mikrotom so, dass der Kondylus und die Kronenseite um 5°-20° mehr hervortreten, um ein integriertes Bild der Kronenpulpa gleichzeitig mit der Wurzelpulpa zu erhalten (Abbildung 2).
3. Vorbereiten der Schnitte
   HINWEIS: Der Kondylus ist immer die erste anatomische Struktur, die geschnitten wird. Wenn es verblasst, kann der Backenzahnbereich in mehrere Scheiben geschnitten werden.
   1. Verschieben Sie den Mikrotombereich auf 5 μm, sammeln Sie alle acht Schichten und suchen Sie in der letzten Schicht nach Dentin. Wenn das Kronendentin zunächst ohne apikales Dentin der Wurzel erscheint, stellen Sie die Probenklemme so ein, dass der Wurzelbereich hervorsteht und umgekehrt.
4. Sammeln der Abschnitte
   Anmerkungen: Der Schnittwinkel ist so lange geeignet, bis das Dentin sowohl im Kronen- als auch im apikalen Bereich gleichmäßig erreicht ist.
   1. Schneiden Sie in diese Richtung und beobachten Sie die Scheiben unter dem Mikroskop, bis das Zahnmark sowohl in der Krone als auch in den Wurzeln erscheint. Sammeln Sie die Schnitte, wenn eine undeutliche Kontur von Backenzähnen auf der Oberfläche der Paraffinprobe¹⁷ erscheint.

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Ergebnisse

Um die praktische Anwendung dieser Methode zu verdeutlichen, wurde der rechte erste Backenzahn des Unterkiefers von zwei gesunden C57BL/6-Mäusen (3 Monate alt, beide weiblich) extrahiert und 1 Woche bzw. 4 Wochen lang beobachtet. Die unbeschädigten linken Mandibeln wurden als gesunde Kontrollen verwendet. Abbildung 1A zeigt die spezifischen Merkmale der chirurgischen Apparatur, einschließlich 26-23 G-Nadeln und einer gezahnten Augenpinzette. Die 26 g Nadel wird punktgenau entnommen und ge...

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Diskussion

Das Modell der Heilung der Mausalveole ist eine wichtige Methode, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Knochenheilung und -regeneration zu entschlüsseln und letztendlich klinische Herausforderungen zu lösen. Bestehende Studien haben die Möglichkeit des Schneidezahnextraktionsmodells und des Oberkiefermolarenextraktionsmodells gezeigt, während Studien nicht das Unterkiefermodell des ersten Molaren verwendet haben^13,17,18...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
23/25/26 G needle	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)
C57/B6J	Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China	C57/B6J
DAPI Staining Solution	Beyotime	Cat#C1005
Embedding Cassettes	CITOTEST Scientific	80106-1100-16
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Biosharp	BL700B
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22-10
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Microtome	Leica	RM2235
Pentobarbital Sodium	Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd	2018042001
Rabbit polyclonal	anti-Sp7	Abcam Cat# ab22552
Tweezers	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB2-115