O Estabelecimento de um Modelo de Cicatrização de Molares Mandibulares Murinos

Resumo

Este protocolo demonstra passo-a-passo detalhes de como extrair o primeiro molar inferior no camundongo. Ele fornece um método alternativo para pesquisadores com foco na cicatrização e regeneração dos ossos maxilares.

Resumo

Este estudo introduz o desenvolvimento de um modelo de extração molar na mandíbula murina para fornecer um modelo viável para o estudo da regeneração óssea alveolar e ossificação intramembranosa. Camundongos C57/J6 foram utilizados para extrair o primeiro molar inferior para estabelecer este modelo. Eles foram sacrificados e as mandíbulas bilaterais retiradas em 1 e 4 semanas pós-cirurgia, respectivamente. Subsequente coleta estereoscópica seriada, avaliação histológica e coloração por imunofluorescência foram realizadas para demonstrar o sucesso da cirurgia. Imediatamente após a cirurgia, as imagens estereoscópicas mostraram um alvéolo de extração vazio. A hematoxilina e a eosina (H&E) em 1 semana e a coloração de Masson em 4 semanas de pós-operatório mostraram que a área da raiz original estava parcial e totalmente preenchida por trabéculas ósseas, respectivamente. A coloração por imunofluorescência mostrou que, em comparação com o lado da homeostase, a expressão de Sp7 aumentou com 1 semana de pós-operatório, sugerindo osteogênese vigorosa na fossa alveolar. Todos esses resultados demonstraram um modelo praticável de cicatrização de alvéolos para extração dentária murina. Estudos futuros revelando os mecanismos de cicatrização de defeitos maxilares ou cicatrização de alvéolos poderão adotar esse método.

Introdução

A cicatrização do alvéolo após exodontia é um cenário clínico comum, que pode resultar em complicações inconsequentes, como hemorragia alveolar, alveolite seca ou mesmo osteomielite mandibular sob cicatrização indesejável ^1,2,3. Essas comorbidades podem comprometer a qualidade de vida dos pacientes e, pior ainda, desafiar vitalmente a reabilitação protética devido à perda óssea^maciça4. Embora os estágios de cicatrização do alvéolo tenham sido elucidados, eles são inadequados para direcionar o cuidado clínico pós-cirurgia de exodontia quando se deparam com vários desafios prognósticos⁴.

Múltiplos estudos baseados em modelos animais têm sido conduzidos para obter uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes no processo de cicatrização do alvéolo e evitar as situações acima. A Sp7 é um regulador mestre na diferenciação osteoblástica, desempenhando um papel vital no desenvolvimento do esqueleto, hemostasia óssea^{e regeneração óssea5,6}. Modelos racionais de cicatrização de alvéolos poderiam mostrar a redundância da Sp7 pós-traumática na regeneração óssea. Além disso, diferentemente da consolidação da fratura de ossos longos, apenas um único processo osteogênico, a ossificação intramembranosa, envolve o processo de cicatrização do alvéolo de^extração7. Isso torna o modelo de extração dentária animal ideal para o estudo de terapias baseadas em implantes, uma vez que a osseointegração de implantes obedece à^{mesma regra} osteogênica8.

Há décadas, o modelo de exodontia vem sendo realizado em ratos, coelhos e cães, uma vez que essas espécies possuem dentes grandes e convenientes para operar 9,10,11. No entanto, dadas as crescentes demandas por modificação genética e como um fundo genético mais adaptativo aos seres humanos, camundongos estão sendo cada vez mais usados para estabelecer um modelo de extração dentária. A partir daí, os pesquisadores puderam desvendar o papel de uma população celular específica no processo de cicatrização usando camundongos modificados pelo genoma, em vez de observar fenótipos apenas¹². Entre os modelos de alvéolos para extração dentária murina, estudos prévios demonstraram o estabelecimento e o processo de cicatrização de alvéolos de extração de dentes maxilares e incisivos^{murinos 13,14,15,16}. No entanto, o padrão de cicatrização do prognóstico e os momentos de detecção e observação podem diferir entre os protocolos. Isso apela para um critério universal para que os estudiosos estabeleçam um modelo de cura de alvéolos murinos.

Este estudo teve como objetivo constituir um modelo prático de cicatrização de alvéolos murinos para as questões acima. Molares mandibulares em camundongos apresentam características morfológicas distintas em relação aos molares superiores e incisivos, trazendo vantagens e desvantagens únicas. Como os modelos com foco na mandíbula murina são atualmente baseados em vácuo, este protocolo tentou fornecer um método realizado para extrair o primeiro molar inferior em camundongos. Esperamos que este protocolo ilumine os pesquisadores básicos com novas ideias para descobrir os mecanismos subjacentes da cicatrização da cavidade e indicar cuidados clínicos.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais neste estudo foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética da Escola de Estomatologia da China Ocidental, Universidade de Sichuan (WCHSIRB-D-2017-041). Camundongos adultos C57BL/6, obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais), foram utilizados para o presente estudo.

1. Preparo pré-cirúrgico

1. Preparação do instrumento
   1. Prepare várias agulhas de seringas descartáveis (26G, 25G, 23G; ver Tabela de Materiais) para serem usadas como elevadores. Flexionar a cabeça da agulha aproximadamente 20°-40°, como mostra a Figura 1.
   2. Prepare pinças oftálmicas dentadas como pinças. Certifique-se de que ele se encaixa no tamanho dos molares dos ratos e pode agarrar os molares com firmeza. O tamanho ideal da pinça é mostrado na Figura 1A, B3.
   3. Obter um elástico (que pode ser arrancado de uma luva médica de látex) para ser usado como abridor de boca, uma placa de espuma ou cortiça como plataforma cirúrgica, um farol para iluminar a área cirúrgica e uma almofada de aquecimento para revitalização pós-operatória. Rasgue uma bola de algodão seca em pequenos pedaços e aplique-a no local cirúrgico se ocorrer sangramento durante o procedimento.
2. Preparo anestésico
   1. O camundongo pode ser anestesiado por qualquer protocolo anestésico adequado que obtenha anestesia geral confirmada através do método de "pinça dos dedos". Após a anestesia, aplique pomada veterinária nos olhos do rato.
      LEGENDA: O protocolo anestésico geral preferido poderia ser: indução e manutenção com xilazina (10 mg/kg) e cetamina (100 mg/kg) por via intraperitoneal (IP);
      Para este estudo, isoflurano e pentobarbital sódico a 1% (50 mg/kg, IP) foram usados para indução e manutenção da anestesia com doses adicionais, conforme necessário.
3. Preparo para Desinfecção e Esterilização
   1. Desinfete a plataforma de operação e a cobertura aérea ao ar livre com um pulverizador de etanol a 75%. Antes de cada procedimento com camundongo, recomenda-se o uso de um novo conjunto de agulhas descartáveis.
      NOTA: As pinças dentadas são reutilizáveis e podem ser esterilizadas usando qualquer método preferido, como esterilização a vapor.

2. Processo cirúrgico

1. Fixação do rato e sua mandíbula
   1. Amarre o rato a uma plataforma cirúrgica em decúbito dorsal com fita adesiva. Fixar duas agulhas de 26 G alinhadas com o plano orbital da orelha e outras duas agulhas de 26 G à vontade abaixo da mandíbula.
   2. Aplique o elástico ao redor das agulhas e atravesse os incisivos para manter a boca aberta. Puxe levemente a língua para fora e fixe-a sob o elástico oposto ao lado cirúrgico, para evitar que obstrua o campo de visão (Figura 1C).
2. Eliminando a resistência distal
   1. Segure o molar com uma pinça mesialmente, force uma agulha 23 G no osso alveolar bucal da raiz distal e feche um intervalo.
      NOTA: Este passo deve ser tomado com muita cautela, pois uma agulha que está embutida muito profunda provavelmente quebrará a raiz.
   2. Em seguida, mude para uma agulha 25G para continuar a expandir o intervalo e progrida delicadamente em direção à área periapical enquanto gira lentamente a agulha para frente e lingualmente (com a posição anatômica do mouse) para pressionar a raiz para fora da fossa alveolar.
3. Eliminando a resistência mesial
   1. Quando houver espaço suficiente, use uma agulha 23 G para inserir no garfo radicular e levantar o molar oclusalmente. Depois de segurar o molar com força, pegue outra agulha 23 G e force-a na membrana periodontal mesial lingual para criar um intervalo.
   2. Em seguida, substitua por uma agulha de 25 G e gire lentamente para frente e bucalmente. Se algum obstáculo subjacente impedir a luxação do molar, use uma agulha 26 G para penetrar no ápice da raiz e repita as operações.
4. Extração final
   1. Extrair o dente e, durante a extração, certifique-se de que a coroa se eleva acima do plano oclusal e que duas raízes intactas possam ser claramente vistas.
      OBS: A luxação (luxação) do dente é considerada o momento mais doloroso e angustiante do procedimento. Antes da luxação do dente, a profundidade anestésica deve ser reavaliada pelo teste da pinça dos dedos dos pés e, consequentemente, uma dose moderada de um agente anestésico deve ser administrada, se necessário.
5. Cuidados pós-operatórios
   1. Após a extração do dente, aplicar algodão seco para estancar o sangramento, reposicionar a língua, administrar carprofeno (5 mg/kg) por via subcutânea e colocar o camundongo em uma almofada de aquecimento em temperatura constante até a recuperação da anestesia.

3. Imagem da mandíbula do camundongo e do alvéolo de extração

1. Preparação das amostras
   1. Eutanásia do camundongo por luxação cervical. Use tesoura oftálmica para cortar os músculos do esqueleto presos à mandíbula e ao arco zigomático. Corte da garganta ao longo da borda inferior da mandíbula até o ramo ascendente e, em seguida, para a parte posterior do côndilo e, em seguida, puxe a mandíbula para baixo e corte ao longo da linha média do incisivo inferior. Dessa forma, as duas mandíbulas separadas são colhidas.
   2. Realizar fixação, desmineralização e desidratação seguindo o procedimento padrão¹⁷. Ao incorporar¹⁷, certifique-se de que o plano oclusal esteja paralelo à borda do (consulte Tabela de Materiais). Fixar a mandíbula na parte inferior do, com sua borda inferior torneada (Figura 2).
      OBS: Este protocolo oferece o plano sagital da região mandibular.
2. Fixação da amostra no micrótomo
   1. Regular a pinça do corpo de prova no micrótomo para projetar o côndilo e o lado da coroa 5°-20° mais, para obter uma imagem integrada da polpa da coroa concomitante com a polpa da raiz (Figura 2).
3. Preparando as seções
   OBS: O côndilo é sempre a primeira estrutura anatômica a ser cortada. Quando desaparece, a área molar pode então ser cortada em várias fatias.
   1. Mude o intervalo do micrótomo para 5 μm, colete a cada oito cortes e procure dentina na última fatia. Se a dentina da coroa aparecer pela primeira vez sem qualquer dentina apical radicular, ajuste a pinça do espécime para fazer a área da raiz se projetar, e vice-versa.
4. Coletando as seções
   NOTA: O ângulo de corte é adequado até que a dentina seja igualmente atingida na coroa e na área apical.
   1. Corte nessa direção e observe as fatias ao microscópio até que a polpa dentária apareça tanto na coroa quanto nas raízes. Coletar os cortes quando aparecer um contorno obscuro de molares na superfície da amostra de parafina¹⁷.

Resultados

Para elucidar o uso prático desse método, o primeiro molar inferior direito de dois camundongos C57BL/6 saudáveis (3 meses de idade, ambos fêmeas) foi extraído e acompanhado por 1 semana e 4 semanas, respectivamente. As mandíbulas esquerdas não danificadas foram usadas como controles saudáveis. A Figura 1A mostra as características específicas do aparelho cirúrgico, incluindo agulhas 26-23 G e um tweezer oftálmico dentado. A agulha 26 G é removida e dobrada. A agulha de 25 G é ...

Discussão

O modelo de cicatrização de alvéolos murinos é um método importante para desvendar os mecanismos subjacentes na cicatrização e regeneração óssea, resolvendo desafios clínicos. Estudos existentes demonstraram a possibilidade do modelo de extração de incisivos e do modelo de extração de molares superiores, enquanto estudos não utilizaram o modelo de primeiro molar inferior13,17,18. No entanto, os incisivos são cru...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
23/25/26 G needle	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)
C57/B6J	Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China	C57/B6J
DAPI Staining Solution	Beyotime	Cat#C1005
Embedding Cassettes	CITOTEST Scientific	80106-1100-16
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Biosharp	BL700B
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22-10
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Microtome	Leica	RM2235
Pentobarbital Sodium	Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd	2018042001
Rabbit polyclonal	anti-Sp7	Abcam Cat# ab22552
Tweezers	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB2-115