הקמת מודל ריפוי שקע מיצוי מולארי מנדיבולרי מורין

Summary

פרוטוקול זה מדגים שלב אחר שלב פרטים כיצד לחלץ את הטוחנת הראשונה המנדיבולרית בעכבר. הוא מספק שיטה חלופית לחוקרים המתמקדים בריפוי והתחדשות עצם הלסת.

Abstract

מחקר זה מציג את הפיתוח של מודל מיצוי מולארי בלסת התחתונה כדי לספק מודל מעשי לחקר התחדשות עצם מכתשית ו ossification intramembranous. עכברי C57/J6 שימשו כדי לחלץ את הטוחנת המנדיבולרית הראשונה כדי לבסס מודל זה. הם הומתו והלסת הדו-צדדית נקטפה, שבוע וארבעה שבועות לאחר הניתוח, בהתאמה. לאחר מכן בוצעו קציר סטריאוסקופי סדרתי, הערכה היסטולוגית וצביעה אימונופלואורסצנטית כדי להדגים ניתוח מוצלח. מיד לאחר הניתוח, התמונות הסטריאוסקופיות הציגו שקע חילוץ ריק. המטוקסילין והאוזין (H&E) בשבוע אחד וצביעת מאסון בשבוע 4 לאחר הניתוח הראו כי אזור השורש המקורי היה מלא באופן חלקי ומלא בטרבקולה של העצם, בהתאמה. צביעת האימונופלואורסנציה הראתה כי בהשוואה לצד ההומאוסטזיס, ביטוי Sp7 גדל שבוע לאחר הניתוח, מה שמרמז על אוסטאוגנזה נמרצת בפוסה הנאדית. כל התוצאות הללו הדגימו מודל מעשי לריפוי ארובת שן מורין. מחקרים עתידיים שיחשפו את המנגנונים של ריפוי פגמים בעצם הלסת או ריפוי ארובות עשויים לאמץ שיטה זו.

Introduction

ריפוי מכתשית לאחר עקירת שן הוא תרחיש קליני נפוץ, אשר יכול לגרום לסיבוכים בלתי הפיכים כגון דימום במכתשית, מכתשית יבשה, או אפילו אוסטאומיאליטיס בלסת תחת ריפוי לא רצוי ^1,2,3. תחלואה נלווית זו עלולה לפגוע באיכות החיים של החולים, ואף גרוע מכך, לאתגר באופן חיוני את שיקום התותבות עקב אובדן עצם מסיבי⁴. למרות ששלבי ריפוי המכתשית הובהרו, הם אינם מספיקים כדי לכוון טיפול קליני לאחר ניתוח עקירת שן כאשר נתקלים באתגרי פרוגנוזה שונים⁴.

מחקרים רבים המבוססים על מודלים של בעלי חיים נערכו כדי להשיג הבנה טובה יותר של המנגנונים הבסיסיים בתהליך ריפוי השקע ולמנוע את המצבים הנ"ל. Sp7 הוא וסת ראשי בהתמיינות אוסטאובלסט, הממלא תפקיד חיוני בהתפתחות השלד, המוסטאזיס עצם והתחדשות עצם ^5,6. מודלים רציונליים של ריפוי שקעים יכולים להציג את היתירות של Sp7 פוסט טראומטית בהתחדשות עצם. בנוסף, להבדיל מריפוי שבר עצם ארוך, רק תהליך אוסטאוגני אחד, אוסיפיקציה תוך ממברנית, כרוך בתהליך הריפוי של שקע המיצוי⁷. זה הופך את מודל עקירת השיניים של בעלי חיים לאופטימלי לחקר טיפולים מבוססי שתלים, מכיוון שאוסאואינטגרציה של השתל מצייתת לאותו כלל אוסטאוגני⁸.

במשך עשרות שנים, מודל עקירת השיניים בוצע בחולדות, ארנבות וכלבים, שכן למינים אלה יש שיניים גדולות ונוחות לניתוח ב 9,10,11. עם זאת, בהתחשב בדרישות המשגשגות לשינוי גנטי וכרקע גנטי מסתגל יותר לבני אדם, עכברים משמשים יותר ויותר לביסוס מודל עקירת שיניים. לאחר מכן, חוקרים יוכלו לפענח את תפקידה של אוכלוסיית תאים מסוימת בתהליך ריפוי הארובה באמצעות עכברים שעברו שינוי גנומי במקום לצפות בפנוטיפים^{רק 12}. בין המודלים של עקירת ארובות שן מורין, מחקרים קודמים הדגימו את תהליך ההקמה והריפוי של ארובות עקירת שן מקסילרית מורין^{וחותכות 13,14,15,16}. עם זאת, דפוס הריפוי של הפרוגנוזה, ונקודות הזמן הבלשיות והתצפיתניות, עשויים להיות שונים בין פרוטוקולים שונים. זה פונה לקריטריון אוניברסלי עבור חוקרים כדי לבסס מודל ריפוי ארובת מורין.

מחקר זה נועד להוות מודל מעשי לריפוי ארובת מורין עבור הנושאים הנ"ל. לטוחנות מנדבליות בעכברים תכונות מורפולוגיות ייחודיות בהשוואה לטוחנות וחותכות מקסילריות, המביאות יתרונות וחסרונות ייחודיים. מכיוון שהמודלים המתמקדים בלסת התחתונה המורין מבוססים כיום על ואקום, פרוטוקול זה ניסה לספק שיטה מוצלחת לחילוץ הטוחנת הראשונה של המנדיבולרית בעכברים. אנו מקווים שפרוטוקול זה יאיר את עיני החוקרים הבסיסיים עם רעיונות חדשים לחשוף מנגנונים בסיסיים של ריפוי ארובתות ולהצביע על טיפול קליני.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים במחקר זה נבדקו ואושרו על ידי הוועדה האתית של בית הספר לסטומטולוגיה של מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן (WCHSIRB-D-2017-041). עכברי C57BL/6 בוגרים, שהתקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים), שימשו במחקר הנוכחי.

1. הכנה טרום ניתוחית

1. הכנת מכשירים
   1. הכינו מחטים שונות של מזרקים חד פעמיים (26G, 25G, 23G; ראו טבלת חומרים) שישמשו כמעליות. החזירו את ראש המחט בערך 20°-40°, כפי שמוצג באיור 1.
   2. הכינו פינצטה אופתלמית עם שיניים כמלקחיים. ודא שהוא מתאים לגודל הטוחנות של העכברים ויכול לתפוס את הטוחנות בחוזקה. גודל הפינצטה האידיאלי מוצג באיור 1A, B3.
   3. הצטיידו בגומייה (אותה ניתן לקרוע מכפפת לטקס רפואית) שתשמש כפותחן פה, לוח קצף או לוח שעם כפלטפורמה כירורגית, פנס ראש להאיר את אזור הניתוח וכרית חימום להחייאת הגוף לאחר הניתוח. לקרוע כדור צמר גפן יבש לחתיכות קטנות ולהחיל אותו על אתר הניתוח אם דימום מתרחשת במהלך ההליך.
2. הכנה להרדמה
   1. ניתן להרדים את העכבר בכל פרוטוקול הרדמה מתאים המשיג הרדמה כללית שאושרה בשיטת 'צביטת הבוהן'. לאחר ההרדמה יש למרוח משחה וטרינרית על עיני העכבר.
      הערה: פרוטוקול הרדמה כללית מועדף יכול להיות: זירוז ותחזוקה עם xylazine (10 מ"ג / ק"ג) וקטמין (100 מ"ג / ק"ג) intraperitoneally (IP);
      במחקר זה, isoflurane ו-1% pentobarbital sodium (50 מ"ג/ק"ג, IP) שימשו להשראת הרדמה ותחזוקה עם מינונים נוספים לפי הצורך.
3. הכנת חיטוי ועיקור
   1. יש לחטא את פלטפורמת התפעול ואת התקורה באוויר הפתוח עם מרסס אתנול 75%. לפני כל הליך עכבר, מומלץ להשתמש בסט חדש של מחטים חד פעמיות.
      הערה: פינצטה עם שיניים ניתנת לשימוש חוזר וניתן לעקר אותה בכל שיטה מועדפת כגון עיקור בקיטור.

2. תהליך כירורגי

1. קיבוע העכבר והלסת התחתונה שלו
   1. קשרו את העכבר למשטח כירורגי במצב שכיבה באמצעות סרט הדבקה. הצמידו שתי מחטים של 26 G בקו אחד למישור האוזן המסלולית ועוד שתי מחטים של 26 G בנחת מתחת ללסת התחתונה.
   2. יש למרוח את הגומייה סביב המחטים ולחצות את החותכות כדי להחזיק את הפה פתוח. משכו מעט את הלשון החוצה וקבעו אותה מתחת לגומייה שממול לצד הניתוחי, כדי למנוע ממנה לחסום את שדה הראייה (איור 1C).
2. ביטול ההתנגדות הדיסטלית
   1. החזיקו את הטוחנת בפינצטה באופן מדיאלי, דחפו מחט 23 גרם לתוך עצם הנאדית הבוקאלית של השורש הדיסטלי, וצרו מרווח.
      הערה: צעד זה חייב להינקט בזהירות רבה, שכן מחט המוטבעת עמוק מדי עלולה להצמיד את השורש.
   2. לאחר מכן, החליפו למחט של 25 גרם כדי להמשיך להרחיב את המרווח, והתקדמו בעדינות לכיוון האזור הפריאפיקלי תוך סיבוב איטי של המחט קדימה ובאופן לשוני (עם המיקום האנטומי של העכבר) כדי ללחוץ את השורש החוצה מהפוסה הנאדית.
3. ביטול ההתנגדות המזיאלית
   1. כאשר יש מספיק מקום, השתמש במחט 23 G כדי להחדיר לתוך מזלג השורש ולהרים את הטוחנת באופן נסתר. לאחר החזקת הטוחנת בחוזקה, קחו מחט נוספת של 23 גרם ודחפו אותה לתוך קרום החניכיים המזיאלי הלשוני כדי ליצור מרווח.
   2. לאחר מכן, להחליף עם מחט 25 G ולאט לאט לסובב קדימה buccally. אם כמה מכשולים בסיסיים מעכבים את הלוקסציה של הטוחנת, השתמש במחט 26 G כדי לחדור את קודקוד השורש, וחזור על הפעולות.
4. חילוץ סופי
   1. יש לעקור את השן ותוך כדי העקירה לוודא שהכתר עולה גבוה מעל מישור החסימה ושניתן לראות בבירור שני שורשים שלמים.
      הערה: לוקסציה (נקע) של השן נחשבת לרגע הכואב והמצער ביותר של ההליך. לפני עקירת השן יש להעריך מחדש את עומק ההרדמה באמצעות בדיקת צביטת הבוהן, ובהתאם לכך יש לתת מינון מתון של חומר הרדמה במידת הצורך.
5. טיפול לאחר הניתוח
   1. לאחר עקירת השן, יש למרוח כותנה יבשה כדי לעצור דימום, למקם מחדש את הלשון, לתת קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג) תת עורית, ולשים את העכבר על כרית חימום בטמפרטורה קבועה עד להחלמה מההרדמה.

3. הדמיה של לסת העכבר ושקע החילוץ

1. הכנת הדגימות
   1. הרדימו את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם. השתמש מספריים אופתלמיים לחתוך את שרירי השלד המחוברים לסת התחתונה ואת הקשת הזיגומטית. חותכים מהגרון לאורך הקצה התחתון של הלסת התחתונה לענף העולה ואז לחלק האחורי של הקונדיל, ואז מושכים את הלסת התחתונה למטה וחותכים לאורך קו האמצע החותך התחתון. בדרך זו קוצרים את שתי הלסתות.
   2. בצע קיבוע, דה-מינרליזציה והתייבשות בהתאם להליך הסטנדרטי¹⁷. בשעת הטבעה¹⁷, יש לוודא שמישור הנסתר מקביל לקצה הקלטת (ראו טבלת חומרים). תקנו את הלסת התחתונה בתחתית הקלטת, כשהקצה התחתון שלה דרוך (איור 2).
      הערה: פרוטוקול זה מציע את מישור הקשת של אזור הלסת התחתונה.
2. תיקון הדגימה על המיקרוטום
   1. לווסת את מהדק הדגימה במיקרוטום כדי להבליט את הקונדיל ואת צד הכתר 5°-20° יותר, כדי לקבל תמונה משולבת של עיסת הכתר במקביל לעיסת השורש (איור 2).
3. הכנת המדורים
   הערה: הקונדיל הוא תמיד המבנה האנטומי הראשון שנחתך. כאשר הוא דוהה, ניתן לחתוך את האזור הטוחנת למספר פרוסות.
   1. הזיזו את טווח המיקרוטום ל-5 מיקרומטר, אספו כל שמונה פרוסות וחפשו דנטין בפרוסה האחרונה. אם דנטין הכתר מופיע לראשונה ללא דנטין אפיקלי שורש, התאימו את מהדק הדגימה כך שאזור השורש יבלוט, ולהיפך.
4. איסוף המדורים
   הערה: זווית החיתוך מתאימה עד להשגת הדנטין באופן שווה הן באזור הכתר והן באזור האפיק.
   1. חותכים בכיוון זה וצופים בפרוסות מתחת למיקרוסקופ עד שמוך השן מופיע הן בכתר והן בשורשים. אספו את הקטעים כאשר מתאר מעורפל של טוחנות מופיע על פני השטח של דגימת פרפין¹⁷.

תוצאות

כדי להבהיר את השימוש המעשי בשיטה זו, הוצאו הטוחנת הראשונה המנדיבולרית הימנית של שני עכברים בריאים C57BL/6 (בני 3 חודשים, שניהם נקבות) ואחריהם במשך שבוע וארבעה שבועות, בהתאמה. הלסת השמאלית שלא ניזוקה שימשה כבקרות בריאות. איור 1A מראה את המאפיינים הספציפיים של מכשיר הניתוח, כולל מ?...

Discussion

מודל ריפוי ארובת המורין הוא שיטה חשובה לפענוח המנגנונים הבסיסיים בריפוי והתחדשות עצם, ובסופו של דבר לפתרון אתגרים קליניים. מחקרים קיימים הוכיחו את האפשרות של מודל מיצוי החותכת ומודל המיצוי המולרי המקסילרי, בעוד שמחקרים לא השתמשו במודל הטוחנת הראשונה של המנדיבולרית^13,17,18

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
23/25/26 G needle	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)
C57/B6J	Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China	C57/B6J
DAPI Staining Solution	Beyotime	Cat#C1005
Embedding Cassettes	CITOTEST Scientific	80106-1100-16
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Biosharp	BL700B
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22-10
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Microtome	Leica	RM2235
Pentobarbital Sodium	Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd	2018042001
Rabbit polyclonal	anti-Sp7	Abcam Cat# ab22552
Tweezers	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB2-115