マウス下顎大臼歯抽出ソケット治癒モデルの確立

要約

このプロトコルは、マウスで下顎第一大臼歯を抽出する方法の段階的な詳細を示しています。これは、顎骨の治癒と再生に焦点を当てた研究者に代替方法を提供します。

要約

本研究では、マウス下顎骨の臼歯抽出モデルの開発を紹介し、歯槽骨再生と膜内骨化の研究に実用的なモデルを提供します。C57/J6マウスを用いて下顎第一大臼歯を抽出し、このモデルを確立した。彼らは安楽死させられ、両側下顎骨は術後1週間と4週間でそれぞれ収穫されました。その後の連続立体視採取、組織学的評価、および免疫蛍光染色を行い、手術の成功を実証した。手術直後、立体画像は空の抽出ソケットを表示しました。術後1週間のヘマトキシリンとエオシン(H&E)、術後4週間のマッソン染色は、元の根の領域がそれぞれ骨梁で部分的および完全に満たされていることを示しました。免疫蛍光染色の結果,術後1週間で恒常性維持側と比較してSp7発現が増加し,肺胞窩の活発な骨形成が示唆された。これらの結果はすべて、実用的なマウス抜歯ソケット治癒モデルを実証しました。顎骨欠損治癒またはソケット治癒のメカニズムを明らかにする今後の研究では、この方法を採用する可能性があります。

概要

抜歯後のソケット治癒は一般的な臨床シナリオであり、望ましくない治癒下でソケット出血、ドライソケット、さらには顎骨髄炎などの合併症を引き起こす可能性があります^1,2,3。これらの併存疾患は、患者の生活の質を損なう可能性があり、さらに悪いことに、大量の骨量減少のために補綴リハビリテーションに極めて挑戦する可能性があります⁴。ソケット治癒段階は解明されていますが、さまざまな予後の課題に遭遇した場合、抜歯手術後の臨床ケアを指示するには不十分です⁴。

ソケット治癒過程の根底にあるメカニズムをよりよく理解し、上記の状況を回避するために、動物モデルに基づく複数の研究が行われています。Sp7は骨芽細胞分化のマスターレギュレーターであり、骨格発生、骨止血、および骨再生に重要な役割を果たしています^5,6。合理的なソケット治癒モデルは、骨再生における心的外傷後のSp7の冗長性を示すことができる。加えて、長骨骨折治癒とは異なる、単一の骨形成過程のみ、膜内骨化は、抽出ソケット⁷の治癒過程を伴う。これにより、インプラントの骨統合は同じ骨形成規則⁸に従うため、動物の抜歯モデルはインプラントベースの治療法の研究に最適です。

何十年もの間、抜歯モデルはラット、ウサギ、および犬で行われてきました、なぜならこれらの種は9,10,11で操作するのに便利な大きな歯を持っているからです。しかし、遺伝子組み換えに対する需要が盛んであり、ヒトへのより適応的な遺伝的背景として、マウスは抜歯モデルを確立するためにますます使用されています。その後、研究者は、表現型を¹²だけ観察する代わりに、ゲノム改変マウスを使用して、ソケット治癒プロセスにおける特定の細胞集団の役割を解明することができました。マウス抜歯ソケットモデルの中で、先行研究では、マウス上顎歯および切歯抜歯ソケットの確立と治癒過程が実証されています^13,14,15,16。ただし、予後の治癒パターン、および検出および観察の時点は、プロトコルによって異なる場合があります。これは、学者がマウスソケットヒーリングモデルを確立するための普遍的な基準に訴えます。

本研究は、上記の課題に対して実行可能なマウスソケットヒーリングモデルを構成することを目的とした。マウスの下顎大臼歯は、上顎大臼歯や切歯と比較して独特の形態学的特徴を持ち、独特の長所と短所をもたらします。マウス下顎骨に焦点を当てたモデルは現在真空ベースであるため、このプロトコルは、マウスで下顎第一大臼歯を抽出するための達成された方法を提供しようとしました。このプロトコルが、ソケット治癒の根底にあるメカニズムを明らかにし、臨床ケアを示すための新しいアイデアを基礎研究者に啓蒙することを願っています。

プロトコル

この研究のすべての動物の手順は、四川大学西中国口腔病学学校の倫理委員会によってレビューおよび承認されました(WCHSIRB-D-2017-041)。市販の供給源( 材料の表を参照)から入手した成体C57BL/6マウスを本研究に使用しました。

1.手術前の準備

1. 楽器の準備
   1. エレベータとして使用する使い捨て注射器(26G、25G、23G、材料 表参照)の各種針を準備します。 図1に示すように、針の頭を約20°〜40°曲げます。
   2. 鉗子として歯付き眼科用ピンセットを準備します。マウスの大臼歯のサイズにフィットし、大臼歯をしっかりとつかむことができることを確認してください。理想的なピンセットのサイズを 図1A、B3に示します。
   3. 口切りとして使用する輪ゴム(医療用ラテックス手袋から引き裂くことができる)、手術プラットフォームとしてのフォームボードまたはコルクボード、手術領域を照らすヘッドランプ、および術後復活用の加熱パッドを入手してください。乾いた綿球を細かく裂き、手術中に出血が発生した場合は手術部位に適用します。
2. 麻酔の準備
   1. マウスは、「つま先ピンチ」法によって確認された全身麻酔を達成する任意の適切な麻酔プロトコルによって麻酔することができる。麻酔後、マウスの目に獣医用軟膏を塗ります。
      注:推奨される全身麻酔プロトコルは次のとおりです:キシラジン(10 mg / kg)およびケタミン(100 mg / kg)の腹腔内(IP)による誘導と維持。
      この研究では、イソフルランと1%ペントバルビタールナトリウム(50 mg / kg、IP)を麻酔の導入と維持に使用し、必要に応じて追加用量を使用しました。
3. 消毒と滅菌の準備
   1. 操作プラットフォームと屋外の頭上を75%エタノール噴霧器で消毒します。各マウスの手順の前に、新しい使い捨て針のセットを使用することをお勧めします。
      注意: 歯付きピンセットは再利用可能であり、蒸気滅菌などの任意の好ましい方法を使用して滅菌できます。

2.手術プロセス

1. マウスとその下顎骨の固定
   1. 粘着テープを使用して、マウスを仰臥位で手術台に結び付けます。2本の26 G針を眼窩耳面に沿って固定し、さらに2本の26 G針を下顎骨の下に簡単に固定します。
   2. 針の周りに輪ゴムをかけ、切歯を交差させて口を開いたままにします。舌を少し引き出し、手術側の反対側の輪ゴムの下に固定して、視野を遮らないようにします(図1C)。
2. 遠位抵抗の解消
   1. 臼歯をピンセットで中程度に持ち、23 Gの針を遠位根の頬側歯槽骨に押し込み、間隔を空けます。
      注意: 深く埋め込まれた針は根元を折る可能性があるため、この手順は細心の注意を払って実行する必要があります。
   2. 次に、 25G の針に変更して間隔を広げ続け、針をゆっくりと前方および舌方向に(マウスの解剖学的位置で)回転させながら、根尖周囲領域に向かって繊細に進行し、歯槽窩の根元を押し出します。
3. 近心抵抗の排除
   1. 十分なスペースがある場合は、23 Gの針を使用してルートフォークに挿入し、大臼歯を咬合状に持ち上げます。大臼歯をしっかりと保持した後、さらに23 Gの針を取り、舌側近心歯周膜に押し込み、間隔を作ります。
   2. 次に、 25 G の針で代用し、ゆっくりと前方に頬側に回転させます。いくつかの根本的な障害が大臼歯の脱臼を妨げる場合は、26 Gの針を使用して根の頂点を貫通し、操作を繰り返します。
4. 最終抽出
   1. 歯を抜歯し、抜歯中にクラウンが咬合面から高く上昇し、2つの無傷の根がはっきりと見えることを確認します。
      注:歯の脱臼(脱臼)は、手順の最も痛みを伴う苦痛な瞬間と見なされます。歯を脱臼させる前に、つま先のピンチテストを使用して麻酔の深さを再評価する必要があり、したがって、必要に応じて適度な用量の麻酔薬を投与する必要があります。
5. 術後ケア
   1. 抜歯後、乾いた綿を塗って出血を止め、舌の位置を変え、カルプロフェン(5 mg / kg)を皮下投与し、麻酔から回復するまでマウスを恒温加熱パッドに置きます。

3.マウスの下顎骨と抽出ソケットのイメージング

1. サンプルの調製
   1. 頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。眼科用ハサミを使用して、下顎骨と頬骨弓に取り付けられた骨格筋を切断します。下顎骨の下端に沿って喉から上行枝まで、次に顆の裏側まで切り取り、次に下顎骨を引き下げて下顎切歯の正中線に沿って切ります。このようにして、2つの別々の下顎骨が収穫されます。
   2. 固定、脱灰、脱水は、標準的な手順¹⁷に従って行います。¹⁷を埋め込むときは、咬合面がカセットの端と平行であることを確認してください( 材料の表を参照)。下顎骨を下端をコックした状態で、カセットの下部に固定します(図2)。
      注:このプロトコルは、下顎骨領域の矢状面を提供します。
2. ミクロトームへのサンプルの固定
   1. ミクロトームの標本クランプを調整して顆とクラウン側を5°〜20°さらに突き出し、根髄に付随するクラウンパルプの統合画像を取得します(図2)。
3. セクションの準備
   注意: 顆は常に最初に切断される解剖学的構造です。それが消えたら、大臼歯領域をいくつかのスライスにカットすることができます。
   1. ミクロトームの範囲を5μmにシフトし、8スライスごとに収集し、最後のスライスで象牙質を探します。歯冠象牙質が根尖象牙質なしで最初に現れる場合は、試験片クランプを調整して根尖部を突き出すようにし、その逆も同様です。
4. セクションの収集
   注意: 象牙質がクラウンと頂端領域の両方で均等に到達するまで、切断角度は適切です。
   1. この方向に沿ってカットし、歯髄が歯冠と根の両方に現れるまで顕微鏡下でスライスを観察します。パラフィン試料¹⁷の表面に臼歯の不明瞭な輪郭が現れたら切片を採取する。

結果

この方法の実用化を解明するため,健常C57BL/6マウス2匹(生後3ヶ月,いずれも雌)の右下顎第一大臼歯を抽出し,それぞれ1週間,4週間追跡した。損傷を受けていない左下顎骨を健康な対照として使用しました。 図1A は、26〜23Gの針および歯付き眼科用ピンセットを含む手術器具の特定の特徴を示す。26Gの針はピンポイントで取り外して曲げます。25Gの針は、ピンポイントで約25...

ディスカッション

マウスソケット治癒モデルは、骨の治癒と再生の根底にあるメカニズムを解明し、最終的に臨床上の課題を解決するための重要な方法です。既存の研究では、切歯抽出モデルと上顎大臼歯抽出モデルの可能性が実証されていますが、研究では下顎第一大臼歯モデルを使用していません^13,17,18。ただし、切歯はげっ歯類の生?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
23/25/26 G needle	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)
C57/B6J	Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China	C57/B6J
DAPI Staining Solution	Beyotime	Cat#C1005
Embedding Cassettes	CITOTEST Scientific	80106-1100-16
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Biosharp	BL700B
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22-10
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Microtome	Leica	RM2235
Pentobarbital Sodium	Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd	2018042001
Rabbit polyclonal	anti-Sp7	Abcam Cat# ab22552
Tweezers	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB2-115