Murin Mandibuler Molar Ekstraksiyon Soket İyileştirme Modelinin Kurulması

Özet

Bu protokol, faredeki mandibular ilk azı dişinin nasıl çıkarılacağına dair adım adım ayrıntıları gösterir. Çene kemiği iyileşmesi ve yenilenmesine odaklanan araştırmacılar için alternatif bir yöntem sunar.

Özet

Bu çalışma, alveoler kemik rejenerasyonu ve intramembranöz ossifikasyonu incelemek için uygulanabilir bir model sağlamak için murin mandibulada bir molar ekstraksiyon modelinin geliştirilmesini tanıtmaktadır. Bu modeli oluşturmak için mandibular ilk azı dişini çıkarmak için C57 / J6 fareleri kullanıldı. Ötanazi yapıldı ve bilateral mandibulalar sırasıyla ameliyattan 1 hafta ve 4 hafta sonra toplandı. Daha sonra seri stereoskopik hasat, histolojik değerlendirme ve immünofloresan boyama başarılı cerrahi göstermek için yapıldı. Ameliyattan hemen sonra, stereoskopik görüntüler boş bir ekstraksiyon soketi gösterdi. 1 haftada hematoksilin ve eozin (H&E) ve ameliyat sonrası 4 haftada Masson boyaması, orijinal kökün alanının sırasıyla kısmen ve tamamen kemik trabekülleri ile dolu olduğunu göstermiştir. İmmünofloresan boyama, homeostaz tarafı ile karşılaştırıldığında, Sp7 ekspresyonunun ameliyattan 1 hafta sonra arttığını ve alveoler fossada güçlü osteogenezi düşündürdüğünü göstermiştir. Tüm bu sonuçlar uygulanabilir bir murin diş çekimi soketi iyileştirme modeli göstermiştir. Çene kemiği defekti iyileşmesi veya soket iyileşmesi mekanizmalarını ortaya koyan yeni çalışmalar bu yöntemi benimseyebilir.

Giriş

Diş çekimi sonrası soket iyileşmesi, istenmeyen iyileşme altında soket kanaması, kuru soket ve hatta çene osteomiyeliti gibi istenmeyen komplikasyonlara neden olabilen yaygın bir klinik senaryodur ^1,2,3. Bu komorbiditeler hastaların yaşam kalitesini bozabilir ve daha da kötüsü, masif kemik kaybı nedeniyle protez rehabilitasyonunu hayati derecede zorlayabilir⁴. Soket iyileşme aşamaları aydınlatılmış olmasına rağmen, çeşitli prognoz zorluklarıyla karşılaşıldığında diş çekimi sonrası cerrahi sonrası klinik bakımı yönlendirmede yetersiz kalmaktadır⁴.

Soket iyileşme sürecinde altta yatan mekanizmaları daha iyi anlamak ve yukarıdaki durumları önlemek için hayvan modellerine dayalı çok sayıda çalışma yapılmıştır. Sp7, osteoblast farklılaşmasında ana düzenleyicidir ve iskelet gelişimi, kemik hemostazı ve kemik rejenerasyonunda hayati bir rol oynar ^5,6. Rasyonel soket iyileşme modelleri, Sp7'nin travma sonrası kemik rejenerasyonundaki fazlalığını gösterebilir. Ek olarak, uzun kemik kırığı iyileşmesinden farklı olarak, sadece tek bir osteojenik süreç, intramembranöz ossifikasyon, ekstraksiyon soketinin iyileşme sürecini içerir⁷. Bu, hayvan dişi çekimi modelini implant tabanlı tedavileri incelemek için en uygun hale getirir, çünkü implant osseointegrasyonu aynı osteojenik kural^8'e uyar.

On yıllar boyunca, diş çekme modeli sıçanlarda, tavşanlarda ve köpeklerde gerçekleştirilmiştir, çünkü bu türler ^9,10,11 üzerinde çalışmaya uygun büyük dişlere sahiptir. Bununla birlikte, genetik modifikasyon için gelişen talepler ve insanlara daha uyarlanabilir bir genetik arka plan olarak, fareler bir diş çekme modeli oluşturmak için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Daha sonra, araştırmacılar fenotipleri sadece¹² gözlemlemek yerine, genomu değiştirilmiş fareleri kullanarak soket iyileşme sürecinde belirli bir hücre popülasyonunun rolünü çözebilirler. Murin diş çekimi soket modelleri arasında, önceki çalışmalar murin maksiller diş ve kesici diş ekstraksiyon soketlerinin kuruluş ve iyileşme sürecini göstermiştir^13,14,15,16. Bununla birlikte, prognozun iyileşme paterni ve dedektif ve gözlemsel zaman noktaları, protokoller arasında farklılık gösterebilir. Bu, akademisyenlerin bir murin soketi iyileştirme modeli oluşturmaları için evrensel bir kritere hitap etmektedir.

Bu çalışmada yukarıdaki konular için uygulanabilir bir murin soket iyileştirme modeli oluşturulması amaçlanmıştır. Farelerdeki mandibula azı dişleri, maksiller azı dişleri ve kesici dişlere kıyasla ayırt edici morfolojik özelliklere sahiptir ve benzersiz avantajlar ve dezavantajlar getirir. Murin mandibulasına odaklanan modeller şu anda vakum bazlı olduğundan, bu protokol farelerde mandibular ilk azı dişini çıkarmak için başarılı bir yöntem sağlamaya çalıştı. Bu protokolün, soket iyileşmesinin altında yatan mekanizmaları ortaya çıkarmak ve klinik bakımı belirtmek için temel araştırmacıları yeni fikirlerle aydınlatacağını umuyoruz.

Protokol

Bu çalışmadaki tüm hayvan prosedürleri, Sichuan Üniversitesi, Batı Çin Stomatoloji Okulu Etik Komitesi (WCHSIRB-D-2017-041) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Bu çalışmada ticari bir kaynaktan elde edilen yetişkin C57BL/6 fareler (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılmıştır.

1. Cerrahi öncesi hazırlık

1. Enstrüman hazırlama
   1. Asansör olarak kullanılmak üzere tek kullanımlık şırıngalardan çeşitli iğneler (26G, 25G, 23G; bakınız Malzeme Tablosu) hazırlayın. İğne kafasını Şekil 1'de gösterildiği gibi yaklaşık 20°-40° döndürün.
   2. Dişli oftalmik cımbızları forseps olarak hazırlayın. Farelerin azı dişlerinin boyutuna uyduğundan ve azı dişlerini sıkıca tutabildiğinden emin olun. İdeal cımbız boyutu Şekil 1A, B3'te gösterilmiştir.
   3. Ağız açıcı olarak kullanılacak bir lastik bant (tıbbi lateks eldivenden yırtılabilir), cerrahi platform olarak bir köpük tahta veya mantar tahtası, cerrahi alanı aydınlatmak için bir far ve ameliyat sonrası canlanma için bir ısıtma yastığı edinin. Kuru bir pamuk topunu küçük parçalara ayırın ve işlem sırasında kanama meydana gelirse cerrahi bölgeye uygulayın.
2. Anestezi hazırlığı
   1. Fare, 'ayak parmağı sıkışma' yöntemi ile onaylanan genel anesteziyi sağlayan herhangi bir uygun anestezi protokolü ile uyuşturulabilir. Anesteziyi takiben, farenin gözlerine veteriner merhem sürün.
      NOT: Tercih edilen genel anestezik protokol şunlar olabilir: intraperitoneal (IP) olarak ksilazin (10 mg / kg) ve ketamin (100 mg / kg) ile indüksiyon ve idame;
      Bu çalışma için anestezi indüksiyonu ve idamesi için izofluran ve %1 pentobarbital sodyum (50 mg/kg, IP) gerektiğinde ek dozlarla kullanıldı.
3. Dezenfeksiyon ve Sterilizasyon hazırlığı
   1. Çalışma platformunu ve açık hava tepegözünü %75 etanol püskürtücü ile dezenfekte edin. Her fare prosedüründen önce, yeni bir tek kullanımlık iğne setinin kullanılması önerilir.
      NOT: Dişli cımbızlar tekrar kullanılabilir ve buhar sterilizasyonu gibi tercih edilen herhangi bir yöntem kullanılarak sterilize edilebilir.

2. Cerrahi süreç

1. Farenin ve mandibulasının sabitlenmesi
   1. Yapışkan bant kullanarak fareyi sırtüstü pozisyonda cerrahi bir platforma bağlayın. İki adet 26 G iğneyi yörüngesel kulak düzlemine uygun olarak ve diğer iki adet 26 G iğneyi de mandibulanın altına rahatça sabitleyin.
   2. Lastik bandı iğnelerin etrafına uygulayın ve ağzı açık tutmak için kesici dişleri çaprazlayın. Görüş alanını engellemesini önlemek için dili hafifçe dışarı çekin ve cerrahi tarafın karşısındaki lastik bandın altına sabitleyin (Şekil 1C).
2. Distal direncin ortadan kaldırılması
   1. Azı dişini cımbızla mesial olarak tutun, 23 G'lik bir iğneyi distal kökün bukkal alveolar kemiğine zorlayın ve bir aralık oluşturun.
      NOT: Bu adım büyük bir dikkatle atılmalıdır, çünkü çok derine gömülü bir iğne muhtemelen kökü koparacaktır.
   2. Daha sonra, aralığı genişletmeye devam etmek için 25 G'lik bir iğneye geçin ve kökü alveolar fossadan dışarı bastırmak için iğneyi yavaşça ileri ve dilsel olarak (fare anatomik pozisyonuyla) döndürürken periapikal bölgeye doğru hassas bir şekilde ilerleyin.
3. Mesial direncin ortadan kaldırılması
   1. Yeterli alan olduğunda, kök çatalına yerleştirmek ve azı dişini oklüzal olarak kaldırmak için 23 G'lik bir iğne kullanın. Azı dişini sıkıca tuttuktan sonra, başka bir 23 G iğnesi alın ve bir aralık oluşturmak için lingual mesial periodontal membrana zorlayın.
   2. Ardından, 25 G'lik bir iğne ile değiştirin ve yavaşça ileri ve bukkal olarak döndürün. Altta yatan bazı engeller azı dişinin lüksasyonunu engelliyorsa, kök tepesine nüfuz etmek için 26 G'lik bir iğne kullanın ve işlemleri tekrarlayın.
4. Son ekstraksiyon
   1. Dişi çekin ve çekerken kronun oklüzal düzlemin üzerinde yükseldiğinden ve iki sağlam kökün açıkça görülebildiğinden emin olun.
      NOT: Dişin lüksasyonu (çıkığı) prosedürün en acı verici ve sıkıntılı anı olarak kabul edilir. Dişin yerinden çıkmasından önce, anestezik derinlik ayak parmağı sıkışma testi kullanılarak yeniden değerlendirilmeli ve buna göre, gerekirse ılımlı bir anestezik ajan dozu uygulanmalıdır.
5. Ameliyat sonrası bakım
   1. Dişi çektikten sonra, kanamayı durdurmak için kuru pamuk uygulayın, dili yeniden konumlandırın, deri altından karprofen (5 mg / kg) uygulayın ve anesteziden iyileşene kadar fareyi sabit bir sıcaklıkta ısıtma yastığına koyun.

3. Fare mandibulasının ve ekstraksiyon soketinin görüntülenmesi

1. Numunelerin hazırlanması
   1. Servikal çıkık ile fareyi ötenazi yapın. Mandibula ve zigomatik kemere bağlı iskelet kaslarını kesmek için oftalmik makas kullanın. Mandibulanın alt kenarı boyunca boğazdan yükselen dala ve daha sonra kondilin arka tarafına kesin ve ardından mandibulayı aşağı çekin ve alt kesici orta çizgi boyunca kesin. Bu şekilde, iki ayrı mandibula hasat edilir.
   2. Standart prosedür^17'yi izleyerek fiksasyon, demineralizasyon ve dehidrasyon gerçekleştirin. ^17'yi gömerken, oklüzal düzlemin kasetin kenarına paralel olduğundan emin olun (bkz. Mandibulayı kasetin alt kısmına, alt kenarı eğimli olacak şekilde sabitleyin (Şekil 2).
      NOT: Bu protokol mandibula bölgesinin sagital düzlemini sunar.
2. Numunenin mikrotom üzerine sabitlenmesi
   1. Kondili ve taç tarafını 5°-20° daha fazla çıkıntı yapmak için mikrotomdaki numune kelepçesini düzenleyerek kök hamuru ile birlikte taç hamurunun entegre bir görüntüsünü elde edin (Şekil 2).
3. Bölümlerin hazırlanması
   NOT: Kondil her zaman kesilecek ilk anatomik yapıdır. Kaybolduğunda, molar alan daha sonra birkaç dilim halinde kesilebilir.
   1. Mikrotom aralığını 5 μm'ye kaydırın, her sekiz dilimde bir toplayın ve son dilimde dentin için keşif yapın. Taç dentini ilk önce herhangi bir kök apikal dentin olmadan ortaya çıkarsa, kök bölgesini çıkıntı yapmak için numune kelepçesini ayarlayın ve bunun tersi de geçerlidir.
4. Bölümlerin toplanması
   NOT: Dentin hem taç hem de apikal alanda eşit olarak elde edilene kadar kesme açısı uygundur.
   1. Bu yönde kesin ve diş pulpası hem taç hem de köklerde görünene kadar dilimleri mikroskop altında izleyin. Parafin örneğinin yüzeyinde belirsiz bir azı dişi konturu göründüğünde kesitleri toplayın¹⁷.

Sonuçlar

Bu yöntemin pratik kullanımını aydınlatmak için, iki sağlıklı C57BL / 6 faresinin (3 aylık, her ikisi de dişi) sağ mandibular ilk azı dişi çıkarıldı ve sırasıyla 1 hafta ve 4 hafta boyunca takip edildi. Hasarsız sol mandibulalar sağlıklı kontrol olarak kullanıldı. Şekil 1A, 26-23 G iğneler ve dişli bir oftalmik cımbız dahil olmak üzere cerrahi cihazın spesifik özelliklerini göstermektedir. 26 G iğne tam olarak çıkarılır ve bükülür. 25 G iğne, nokta...

Tartışmalar

Murin soket iyileştirme modeli, kemik iyileşmesi ve rejenerasyonunda altta yatan mekanizmaları çözmek ve sonuçta klinik zorlukları çözmek için önemli bir yöntemdir. Mevcut çalışmalar kesici diş ekstraksiyon modeli ve maksiller molar ekstraksiyon modelinin olasılığını gösterirken, çalışmalar mandibular birinci molar model^13,17,18'i kullanmamıştır. Bununla birlikte, kesici dişler kemirgen yaşamı içi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
23/25/26 G needle	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)
C57/B6J	Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China	C57/B6J
DAPI Staining Solution	Beyotime	Cat#C1005
Embedding Cassettes	CITOTEST Scientific	80106-1100-16
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Biosharp	BL700B
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22-10
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Microtome	Leica	RM2235
Pentobarbital Sodium	Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd	2018042001
Rabbit polyclonal	anti-Sp7	Abcam Cat# ab22552
Tweezers	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB2-115