Создание модели заживления лунки для извлечения нижней челюсти мышей

Резюме

Этот протокол демонстрирует пошаговые инструкции по извлечению первого моляра нижней челюсти у мыши. Он предоставляет альтернативный метод для исследователей, занимающихся заживлением и регенерацией челюстной кости.

Аннотация

В этом исследовании представлена разработка модели молярной экстракции в нижней челюсти мышей, чтобы обеспечить практическую модель для изучения регенерации альвеолярной кости и интрамембранозного окостенения. Мыши C57 / J6 были использованы для извлечения первого моляра нижней челюсти, чтобы создать эту модель. Они были усыплены, а двусторонние челюсти собраны через 1 неделю и 4 недели после операции соответственно. Последующий серийный стереоскопический сбор, гистологическая оценка и иммунофлюоресцентное окрашивание были выполнены, чтобы продемонстрировать успешную операцию. Сразу после операции на стереоскопических изображениях было видно пустое гнездо для экстракции. Гематоксилин и эозин (H&E) через 1 неделю и окрашивание по Массону через 4 недели после операции показали, что область исходного корня была частично и полностью заполнена костными трабекулами соответственно. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что по сравнению со стороной гомеостаза экспрессия Sp7 увеличилась через 1 неделю после операции, что свидетельствует о энергичном остеогенезе в альвеолярной ямке. Все эти результаты продемонстрировали практическую модель заживления лунки при удалении зуба у мышей. Предстоящие исследования, раскрывающие механизмы заживления дефекта челюстной кости или заживления лунки, могут использовать этот метод.

Введение

Заживление лунки после удаления зуба является распространенным клиническим сценарием, который может привести к нехарактерным осложнениям, таким как кровоизлияние в лунку, сухая лунка или даже остеомиелит челюсти при нежелательном заживлении ^1,2,3. Эти сопутствующие заболевания могут ухудшить качество жизни пациентов и, что еще хуже, серьезно затруднить протезную реабилитацию из-за массивной потери костной массы⁴. Несмотря на то, что этапы заживления лунки были выяснены, они недостаточны для непосредственной клинической помощи после операции по удалению зуба при столкновении с различными проблемами прогноза⁴.

Было проведено множество исследований, основанных на животных моделях, чтобы лучше понять основные механизмы процесса заживления лунки и предотвратить вышеуказанные ситуации. Sp7 является главным регулятором дифференцировки остеобластов, играя жизненно важную роль в развитии скелета, костном гемостазе и регенерации кости ^5,6. Рациональные модели заживления лунки могут показать избыточность посттравматического Sp7 при регенерации кости. Кроме того, в отличие от заживления перелома длинной кости, только один остеогенный процесс, интрамембранозное окостенение, включает процесс заживления лунки⁷ удаления. Это делает модель удаления зубов животных оптимальной для изучения методов лечения на основе имплантатов, поскольку остеоинтеграция имплантатов подчиняется тому же остеогенному правилу⁸.

На протяжении десятилетий модель удаления зубов выполнялась на крысах, кроликах и собаках, поскольку у этих видов большие зубы, которыми удобно оперировать^на 9,10,11. Однако, учитывая растущий спрос на генетическую модификацию и в качестве более адаптивного генетического фона для людей, мыши все чаще используются для создания модели удаления зубов. С этого момента исследователи смогут разгадать роль конкретной клеточной популяции в процессе заживления гнезда, используя модифицированных геномом мышей, вместо того, чтобы наблюдать фенотипы только¹². Среди моделей лунок для удаления зубов мышей предыдущие исследования продемонстрировали процесс установления и заживления лунок для удаления верхнечелюстного зуба мыши и резцов^13,14,15,16. Тем не менее, характер заживления прогноза, а также моменты времени детектива и наблюдения могут различаться в зависимости от протокола. Это апеллирует к универсальному критерию для ученых для создания модели заживления мышиной лунки.

Это исследование было направлено на создание практической модели заживления мышиных лунок для вышеуказанных проблем. Нижнечелюстные моляры у мышей имеют отличительные морфологические черты по сравнению с верхнечелюстными молярами и резцами, что дает уникальные преимущества и недостатки. Поскольку модели, ориентированные на мышечную челюсть, в настоящее время основаны на вакууме, этот протокол пытался предоставить совершенный метод извлечения первого моляра нижней челюсти у мышей. Мы надеемся, что этот протокол просветит фундаментальных исследователей новыми идеями, чтобы раскрыть основные механизмы заживления лунок и указать клиническую помощь.

протокол

Все процедуры на животных в этом исследовании были рассмотрены и одобрены Этическим комитетом Западно-Китайской школы стоматологии Сычуаньского университета (WCHSIRB-D-2017-041). Взрослые мыши C57BL/6, полученные из коммерческого источника (см. Таблицу материалов), были использованы для настоящего исследования.

1. Предоперационная подготовка

1. Подготовка инструмента
   1. Подготовьте различные иглы одноразовых шприцев (26G, 25G, 23G; см. Таблицу материалов) для использования в качестве элеваторов. Наклоните головку иглы примерно на 20°-40°, как показано на рисунке 1.
   2. Подготовьте зубчатый глазной пинцет в качестве щипцов. Убедитесь, что он соответствует размеру коренных зубов мышей и может надежно захватывать коренные зубы. Идеальный размер пинцета показан на рисунке 1A, B3.
   3. Приобретите резинку (которую можно оторвать от медицинской латексной перчатки) для использования в качестве открывателя рта, пенопластовую доску или пробковую доску в качестве хирургической платформы, налобный фонарь для освещения хирургической области и грелку для послеоперационного восстановления. Разорвите сухой ватный тампон на мелкие кусочки и приложите его к месту операции, если во время процедуры возникает кровотечение.
2. Подготовка к анестезии
   1. Мышь может быть анестезирована любым подходящим протоколом анестезии, который обеспечивает общую анестезию, подтвержденную методом «защемления пальцев ног». После анестезии нанесите ветеринарную мазь на глаза мыши.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительным протоколом общей анестезии может быть: индукция и поддерживающая терапия ксилазином (10 мг / кг) и кетамином (100 мг / кг) внутрибрюшинно (IP);
      Для этого исследования изофлуран и 1% пентобарбитал натрия (50 мг / кг, IP) использовали для индукции анестезии и поддержания с дополнительными дозами по мере необходимости.
3. Подготовка к дезинфекции и стерилизации
   1. Продезинфицируйте рабочую платформу и верхнюю часть поля под открытым небом с помощью 75% распылителя этанола. Перед каждой процедурой мыши рекомендуется использовать новый набор одноразовых игл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зубчатый пинцет многоразовый и может быть стерилизован любым предпочтительным методом, таким как паровая стерилизация.

2. Хирургический процесс

1. Фиксация мыши и ее нижней челюсти
   1. Привяжите мышь к хирургической платформе в положении лежа на спине с помощью скотча. Прикрепите две иглы 26 G на одной линии плоскости орбитального уха и еще две иглы 26 G под нижней челюстью.
   2. Наложите резинку на иглы и скрестите резцы, чтобы держать рот открытым. Слегка вытяните язык наружу и зафиксируйте его под резинкой напротив хирургической стороны, чтобы она не загораживала поле зрения (рис. 1С).
2. Устранение дистального сопротивления
   1. Удерживайте коренной зуб пинцетом мезиально, вставьте иглу 23 G в щечную альвеолярную кость дистального корешка и сделайте интервал.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг следует делать с большой осторожностью, так как слишком глубокая игла, скорее всего, сломает корень.
   2. Затем переключитесь на иглу 25 G , чтобы продолжать расширять интервал, и осторожно продвигайтесь к периапикальной области, медленно вращая иглу вперед и лингвально (с анатомическим положением мыши), чтобы выдавить корень из альвеолярной ямки.
3. Устранение мезиального сопротивления
   1. Когда будет достаточно места, используйте иглу 23 G, чтобы вставить ее в корневую вилку и окклюзионно поднять моляр. Плотно удерживая моляр, возьмите еще одну иглу 23 G и вставьте ее в язычную мезиальную мембрану пародонта, чтобы создать интервал.
   2. Затем замените иглой 25 G и медленно вращайте вперед и буккально. Если некоторые основные препятствия препятствуют вывиху моляра, используйте иглу 26 G, чтобы проникнуть в верхушку корня, и повторите операции.
4. Окончательная экстракция
   1. Извлеките зуб и во время удаления убедитесь, что коронка возвышается высоко над окклюзионной плоскостью и что хорошо видны два неповрежденных корня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вывих (вывих) зуба считается самым болезненным и мучительным моментом процедуры. Перед вывихом зуба следует повторно оценить глубину анестезии с помощью теста на защемление пальца ноги, и, соответственно, при необходимости следует ввести умеренную дозу анестетика.
5. Послеоперационный уход
   1. После удаления зуба приложите сухую вату, чтобы остановить кровотечение, переместите язык, введите карпрофен (5 мг / кг) подкожно и положите мышь на грелку с постоянной температурой до восстановления после анестезии.

3. Визуализация нижней челюсти мыши и гнезда для извлечения

1. Подготовка образцов
   1. Усыпить мышь вывихом шейки матки. Используйте офтальмологические ножницы, чтобы разрезать скелетные мышцы, прикрепленные к нижней челюсти и скуловой дуге. Разрежьте от горла по нижнему краю нижней челюсти до восходящей ветви и затем до задней стороны мыщелка, а затем потяните нижнюю челюсть вниз и разрежьте по средней линии нижнего резца. Таким образом, собирают две отдельные челюсти.
   2. Выполняйте фиксацию, деминерализацию и обезвоживание в соответствии со стандартной процедурой¹⁷. При встраивании¹⁷ убедитесь, что окклюзионная плоскость параллельна краю кассеты (см. Таблицу материалов). Закрепите нижнюю челюсть на нижней части кассеты, при этом ее нижний край взведен (рис. 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предлагает сагиттальную плоскость области нижней челюсти.
2. Фиксация образца на микротоме
   1. Отрегулируйте зажим образца в микротоме, чтобы выпячивать мыщелок и сторону коронки еще на 5-20 °, чтобы получить интегрированное изображение мякоти кроны, сопутствующей пульпе корня (рис. 2).
3. Подготовка разделов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыщелок всегда является первой анатомической структурой, подлежащей разрезанию. Когда он исчезнет, молярную область можно разрезать на несколько ломтиков.
   1. Сдвиньте диапазон микротомов до 5 мкм, собирайте каждые восемь срезов и разведывайте дентин в последнем срезе. Если коронковый дентин впервые появляется без апикального дентина корня, отрегулируйте зажим образца, чтобы область корня выступала, и наоборот.
4. Сбор разделов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Угол среза подходит до тех пор, пока дентин не будет одинаково достигнут как в коронке, так и в апикальной области.
   1. Разрежьте в этом направлении и наблюдайте за срезами под микроскопом, пока пульпа зуба не появится как в коронке, так и в корнях. Собирают срезы, когда на поверхности образца^{парафина 17} появляется неясный контур моляров.

Результаты

Чтобы прояснить практическое использование этого метода, был извлечен первый моляр правой нижней челюсти двух здоровых мышей C57BL / 6 (3 месяца, обе самки) и наблюдался в течение 1 недели и 4 недель соответственно. Неповрежденные левые челюсти использовались в качестве здоровой контрольно?...

Обсуждение

Модель заживления мышиной лунки является важным методом для раскрытия основных механизмов заживления и регенерации костей, что в конечном итоге решает клинические проблемы. Существующие исследования продемонстрировали возможность модели экстракции резцов и модели экстракции верхн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
23/25/26 G needle	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)
C57/B6J	Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China	C57/B6J
DAPI Staining Solution	Beyotime	Cat#C1005
Embedding Cassettes	CITOTEST Scientific	80106-1100-16
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Biosharp	BL700B
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22-10
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Microtome	Leica	RM2235
Pentobarbital Sodium	Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd	2018042001
Rabbit polyclonal	anti-Sp7	Abcam Cat# ab22552
Tweezers	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB2-115