L'istituzione di un modello murino di guarigione dell'orbita di estrazione molare mandibolare

Riepilogo

Questo protocollo dimostra i dettagli passo-passo su come estrarre il primo molare mandibolare nel topo. Fornisce un metodo alternativo per i ricercatori che si concentrano sulla guarigione e la rigenerazione della mandibola.

Abstract

Questo studio introduce lo sviluppo di un modello di estrazione molare nella mandibola murina per fornire un modello praticabile per lo studio della rigenerazione ossea alveolare e dell'ossificazione intramembranosa. I topi C57/J6 sono stati utilizzati per estrarre il primo molare mandibolare per stabilire questo modello. Sono stati eutanasizzati e le mandibole bilaterali raccolte, rispettivamente a 1 settimana e 4 settimane dopo l'intervento. La successiva raccolta stereoscopica seriale, la valutazione istologica e la colorazione con immunofluorescenza sono state eseguite per dimostrare il successo della chirurgia. Subito dopo l'intervento chirurgico, le immagini stereoscopiche mostravano una presa di estrazione vuota. L'ematossilina e l'eosina (H & E) a 1 settimana e la colorazione Masson a 4 settimane dopo l'intervento chirurgico hanno mostrato che l'area della radice originale era parzialmente e completamente riempita con trabecole ossee, rispettivamente. La colorazione con immunofluorescenza ha mostrato che, rispetto al lato omeostasi, l'espressione di Sp7 è aumentata a 1 settimana dopo l'intervento, suggerendo un'osteogenesi vigorosa nella fossa alveolare. Tutti questi risultati hanno dimostrato un modello praticabile di guarigione dell'alveolo di estrazione del dente murino. I prossimi studi che rivelano i meccanismi di guarigione dei difetti dell'osso mascellare o della guarigione dell'alveolo potrebbero adottare questo metodo.

Introduzione

La guarigione dell'alveolo dopo l'estrazione del dente è uno scenario clinico comune, che può causare complicazioni sconvenienti come emorragia dell'orbita, presa secca o persino osteomielite della mascella in caso di guarigione indesiderata ^1,2,3. Queste comorbidità possono compromettere la qualità della vita dei pazienti e, peggio ancora, sfidare in modo vitale la riabilitazione protesica a causa della massiccia perdita ossea⁴. Sebbene le fasi di guarigione dell'alveolo siano state chiarite, sono inadeguate per dirigere l'assistenza clinica post-chirurgia di estrazione dentale quando si incontrano varie sfide prognosi⁴.

Sono stati condotti diversi studi basati su modelli animali per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi sottostanti nel processo di guarigione dell'alveolo e prevenire le situazioni di cui sopra. Sp7 è un regolatore principale nella differenziazione degli osteoblasti, svolgendo un ruolo vitale nello sviluppo dello scheletro, nell'emostasi ossea e nella rigenerazione ossea ^5,6. I modelli di guarigione delle prese razionali potrebbero mostrare la ridondanza di Sp7 post-traumatica nella rigenerazione ossea. Inoltre, a differenza della guarigione delle fratture ossee lunghe, solo un singolo processo osteogenico, l'ossificazione intramembranosa, comporta il processo di guarigione della presa di estrazione⁷. Ciò rende il modello di estrazione del dente animale ottimale per lo studio di terapie basate su impianti, poiché l'osteointegrazione dell'impianto obbedisce alla stessa regola osteogenica⁸.

Per decenni, il modello di estrazione dei denti è stato eseguito su ratti, conigli e cani, poiché queste specie hanno denti grandi che sono convenienti per operare su 9,10,11. Tuttavia, date le fiorenti richieste di modificazione genetica e come background genetico più adattabile agli esseri umani, i topi vengono sempre più utilizzati per stabilire un modello di estrazione dei denti. Da quel momento in poi, i ricercatori potrebbero svelare il ruolo di una specifica popolazione cellulare nel processo di guarigione della presa usando topi modificati dal genoma invece di osservare fenotipi solo¹². Tra i modelli di presa per l'estrazione dei denti murini, studi precedenti hanno dimostrato l'istituzione e il processo di guarigione del dente masculare murino e delle prese di estrazione degli incisivi^13,14,15,16. Tuttavia, il modello di guarigione della prognosi e i punti temporali detective e osservativi possono differire tra i protocolli. Questo fa appello a un criterio universale per gli studiosi per stabilire un modello di guarigione della presa murina.

Questo studio mirava a costituire un modello praticabile di guarigione della presa murina per i problemi di cui sopra. I molari della mandibola nei topi hanno tratti morfologici distintivi rispetto ai molari mascellari e agli incisivi, portando vantaggi e svantaggi unici. Poiché i modelli incentrati sulla mandibola murina sono attualmente basati sul vuoto, questo protocollo ha cercato di fornire un metodo compiuto per estrarre il primo molare mandibolare nei topi. Speriamo che questo protocollo illumini i ricercatori di base con nuove idee per scoprire i meccanismi sottostanti della guarigione delle prese e indicare la cura clinica.

Protocollo

Tutte le procedure animali in questo studio sono state esaminate e approvate dal Comitato etico della West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2017-041). Per il presente studio sono stati utilizzati topi adulti C57BL/6, ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparazione prechirurgica

1. Preparazione dello strumento
   1. Preparare vari aghi di siringhe monouso (26G, 25G, 23G; vedi Tabella dei materiali) da utilizzare come ascensori. Inflettere la testa dell'ago di circa 20°-40°, come mostrato nella Figura 1.
   2. Preparare pinzette oftalmiche dentate come pinze. Assicurati che si adatti alle dimensioni dei molari dei topi e possa afferrare saldamente i molari. La dimensione ideale della pinzetta è mostrata in Figura 1A, B3.
   3. Procurarsi un elastico (che può essere strappato da un guanto medico in lattice) da utilizzare come apri bocca, un pannello di schiuma o un sughero come piattaforma chirurgica, una lampada frontale per illuminare l'area chirurgica e una piastra riscaldante per il risveglio postoperatorio. Strappare un batuffolo di cotone asciutto in piccoli pezzi e applicarlo al sito chirurgico se si verifica sanguinamento durante la procedura.
2. Preparazione all'anestesia
   1. Il topo può essere anestetizzato da qualsiasi protocollo anestetico adatto che raggiunga l'anestesia generale confermata attraverso il metodo "pizzico del piede". Dopo l'anestesia, applicare un unguento veterinario sugli occhi del topo.
      NOTA: Il protocollo di anestesia generale preferito potrebbe essere: induzione e mantenimento con xilazina (10 mg/kg) e ketamina (100 mg/kg) per via intraperitoneale (IP);
      Per questo studio, l'isoflurano e l'1% di pentobarbital sodico (50 mg/kg, IP) sono stati utilizzati per l'induzione e il mantenimento dell'anestesia con dosi aggiuntive secondo necessità.
3. Preparazione per la disinfezione e la sterilizzazione
   1. Disinfettare la piattaforma operativa e la sostra all'aperto con uno spruzzatore di etanolo al 75%. Prima di ogni procedura del mouse, si raccomanda l'uso di un nuovo set di aghi monouso.
      NOTA: Le pinzette dentate sono riutilizzabili e possono essere sterilizzate utilizzando qualsiasi metodo preferito come la sterilizzazione a vapore.

2. Processo chirurgico

1. Fissazione del topo e della sua mandibola
   1. Legare il mouse a una piattaforma chirurgica in posizione supina usando del nastro adesivo. Appuntare due aghi da 26 G in linea con il piano orbitale dell'orecchio e altri due aghi da 26 G a proprio agio sotto la mandibola.
   2. Applicare l'elastico intorno agli aghi e incrociare gli incisivi per tenere la bocca aperta. Tirare leggermente fuori la lingua e fissarla sotto l'elastico opposto al lato chirurgico, per evitare che ostruisca il campo visivo (Figura 1C).
2. Eliminazione della resistenza distale
   1. Tenere il molare con una pinzetta mesialmente, forzare un ago da 23 G nell'osso alveolare buccale della radice distale e rendere un intervallo.
      NOTA: Questo passaggio deve essere preso con molta cautela, poiché un ago che è incorporato troppo in profondità probabilmente farà scattare la radice.
   2. Quindi, passare a un ago da 25 G per continuare ad espandere l'intervallo e progredire delicatamente verso l'area periapicale mentre si ruota lentamente l'ago in avanti e lingualmente (con la posizione anatomica del topo) per premere la radice fuori dalla fossa alveolare.
3. Eliminazione della resistenza mesiale
   1. Quando c'è abbastanza spazio, utilizzare un ago da 23 G da inserire nella forcella della radice e sollevare occlusalmente il molare. Dopo aver tenuto saldamente il molare, prendere un altro ago da 23 G e forzarlo nella membrana parodontale mesiale linguale per creare un intervallo.
   2. Quindi, sostituire con un ago da 25 G e ruotare lentamente in avanti e buccalmente. Se alcuni ostacoli sottostanti impediscono la lussazione del molare, utilizzare un ago da 26 G per penetrare nell'apice della radice e ripetere le operazioni.
4. Estrazione finale
   1. Estrarre il dente e, durante l'estrazione, assicurarsi che la corona si alzi in alto sopra il piano occlusale e che due radici intatte possano essere chiaramente visibili.
      NOTA: La lussazione (lussazione) del dente è considerata il momento più doloroso e angosciante della procedura. Prima di dislocare il dente, la profondità dell'anestetico deve essere rivalutata utilizzando il test del pizzicamento della punta e, di conseguenza, deve essere somministrata una dose moderata di un agente anestetico, se necessario.
5. Assistenza post-operatoria
   1. Dopo aver estratto il dente, applicare cotone asciutto per fermare il sanguinamento, riposizionare la lingua, somministrare carprofen (5 mg / kg) per via sottocutanea e mettere il topo su una piastra riscaldante a temperatura costante fino al recupero dall'anestesia.

3. Imaging della mandibola del topo e della presa di estrazione

1. Preparazione dei campioni
   1. Eutanasia del topo per dislocazione cervicale. Usa le forbici oftalmiche per tagliare i muscoli dello scheletro attaccati alla mandibola e all'arco zigomatico. Tagliare dalla gola lungo il bordo inferiore della mandibola fino al ramo ascendente e poi alla parte posteriore del condilo, quindi tirare la mandibola verso il basso e tagliare lungo la linea mediana dell'incisivo inferiore. In questo modo, vengono raccolte le due mandibole separate.
   2. Eseguire fissazione, demineralizzazione e disidratazione seguendo la procedura standard¹⁷. Quando incorporate¹⁷, assicuratevi che il piano occlusale sia parallelo al bordo della cassetta (vedere Tabella dei materiali). Fissare la mandibola sul fondo della cassetta, con il bordo inferiore armato (Figura 2).
      NOTA: Questo protocollo offre il piano sagittale dell'area della mandibola.
2. Fissaggio del campione sul microtomo
   1. Regolare il morsetto del campione nel microtomo per sporgere il condilo e il lato della corona di 5°-20° in più, per ottenere un'immagine integrata della polpa della corona concomitante con la polpa della radice (Figura 2).
3. Preparazione delle sezioni
   NOTA: Il condilo è sempre la prima struttura anatomica ad essere tagliata. Quando svanisce, l'area molare può essere tagliata in diverse fette.
   1. Spostare l'intervallo del microtomo a 5 μm, raccogliere ogni otto fette e cercare la dentina nell'ultima fetta. Se la dentina corona appare per la prima volta senza alcuna dentina apicale della radice, regolare il morsetto del campione per far sporgere l'area della radice e viceversa.
4. Raccolta delle sezioni
   NOTA: L'angolo di taglio è appropriato fino a quando la dentina non è ugualmente raggiunta sia nella corona che nell'area apicale.
   1. Tagliare lungo questa direzione e guardare le fette al microscopio fino a quando la polpa dentale appare sia nella corona che nelle radici. Raccogliere le sezioni quando un contorno oscuro di molari appare sulla superficie del campione di paraffina¹⁷.

Risultati

Per chiarire l'uso pratico di questo metodo, il primo molare mandibolare destro di due topi C57BL / 6 sani (3 mesi, entrambi femmine) è stato estratto e seguito per 1 settimana e 4 settimane, rispettivamente. Le mandibole sinistre non danneggiate sono state utilizzate come controlli sani. La figura 1A mostra le caratteristiche specifiche dell'apparecchio chirurgico, tra cui aghi da 26-23 G e una pinzetta oftalmica dentata. L'ago da 26 G viene rimosso e piegato. L'ago da 25 G è piegato a ci...

Discussione

Il modello di guarigione della presa murina è un metodo importante per svelare i meccanismi sottostanti nella guarigione e nella rigenerazione ossea, risolvendo in definitiva le sfide cliniche. Gli studi esistenti hanno dimostrato la possibilità del modello di estrazione degli incisivi e del modello di estrazione molare mascellare, mentre gli studi non hanno utilizzato il modello mandibolare del primo molare^13,17,18. Tuttavia,...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
23/25/26 G needle	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)
C57/B6J	Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China	C57/B6J
DAPI Staining Solution	Beyotime	Cat#C1005
Embedding Cassettes	CITOTEST Scientific	80106-1100-16
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Biosharp	BL700B
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22-10
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Microtome	Leica	RM2235
Pentobarbital Sodium	Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd	2018042001
Rabbit polyclonal	anti-Sp7	Abcam Cat# ab22552
Tweezers	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB2-115