JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف الطرق الحالية نهجا غير متناسب لتصوير الكالسيوم عالي الدقة وشبه المجزأ في الجسم الحي في Caenorhabditis elegans باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا المتاحة بسهولة.

Abstract

تم استخدام تصوير الكالسيوم (Ca 2+) إلى حد كبير لفحص النشاط العصبي ، ولكن أصبح من الواضح بشكل متزايد أن معالجة Ca2+ تحت الخلوية هي عنصر حاسم في الإشارات داخل الخلايا. أثبت تصور ديناميكيات Ca2+ تحت الخلوية في الجسم الحي ، حيث يمكن دراسة الخلايا العصبية في دوائرها الأصلية السليمة ، أنه يمثل تحديا تقنيا في الأنظمة العصبية المعقدة. تتيح الشفافية والجهاز العصبي البسيط نسبيا للديدان الخيطية Caenorhabditis elegans التعبير الخاص بالخلية والتصور في الجسم الحي لعلامات ومؤشرات الفلورسنت. من بين هذه المؤشرات الفلورية التي تم تعديلها للاستخدام في السيتوبلازم وكذلك المقصورات تحت الخلوية المختلفة ، مثل الميتوكوندريا. يتيح هذا البروتوكول التصوير غير النسبي Ca 2+ في الجسم الحي بدقة تحت خلوية تسمح بتحليل ديناميكيات Ca2+ وصولا إلى مستوى العمود الفقري التغصني الفردي والميتوكوندريا. هنا ، يتم استخدام مؤشرين متاحين مشفرين وراثيا مع تقارب Ca 2+ مختلف لإثبات استخدام هذا البروتوكول لقياس مستويات Ca2+ النسبية داخل السيتوبلازم أو مصفوفة الميتوكوندريا في زوج واحد من الخلايا العصبية البينية المثيرة (AVA). جنبا إلى جنب مع التلاعب الجيني والملاحظات الطولية الممكنة في C. elegans ، قد يكون بروتوكول التصوير هذا مفيدا للإجابة على الأسئلة المتعلقة بكيفية تنظيم معالجة Ca2+ لوظيفة الخلايا العصبية واللدونة.

Introduction

أيونات الكالسيوم (Ca2+) هي ناقلات متعددة الاستخدامات للمعلومات في العديد من أنواع الخلايا. في الخلايا العصبية ، يكون Ca2+ مسؤولا عن إطلاق الناقلات العصبية المعتمدة على النشاط ، وتنظيم الحركة الهيكلية الخلوية ، وضبط عمليات التمثيل الغذائي ، بالإضافة إلى العديد من الآليات الأخرى اللازمة للصيانة العصبية المناسبة والوظيفة 1,2. لضمان الإشارات الفعالة داخل الخلايا ، يجب أن تحافظ الخلايا العصبية على مستويات منخفضة من الكالسيومالقاعدي 2+ في السيتوبلازم3. يتم تحقيق ذلك من خلال آليات معالجة Ca 2+ التعاونية ، بما في ذلك امتصاص Ca2+ في العضيات مثل الشبكة الإندوبلازمية (ER) والميتوكوندريا. هذه العمليات ، بالإضافة إلى ترتيب القنوات الأيونية المنفذة للكالسيوم 2+ في غشاء البلازما ، تؤدي إلى مستويات غير متجانسة من السيتوبلازم Ca2+ في جميع أنحاء الخلايا العصبية.

يسمح عدم التجانس Ca 2+ أثناء الراحة والتنشيط العصبي بالتنظيم المتنوع والخاص بالموقع للآليات المعتمدة على Ca 2+ 1. أحد الأمثلة على التأثيرات الخاصة بالتركيز ل Ca 2+ هو إطلاق Ca 2+ من ER من خلال مستقبلات الإينوزيتول 1,4,5-trisphosphate (InsP 3). مطلوب مستويات منخفضة من الكالسيوم2+ بالاشتراك مع InsP3 لفتح مسام مستقبلات الكالسيوم القابلة للاختراق. بدلا من ذلك ، تمنع مستويات الكالسيوم2+ المرتفعة بشكل مباشر وغير مباشر المستقبل4. يتم دعم أهمية توازن Ca 2+ للوظيفة العصبية المناسبة من خلال الأدلة التي تشير إلى أن المعالجة والإشارات داخل الخلايا Ca2+ المعطلة هي خطوة مبكرة في التسبب في الاضطرابات التنكسية العصبية والشيخوخة الطبيعية 5,6. على وجه التحديد ، يرتبط امتصاص الكالسيوم2+ غير الطبيعي والإفراج عنه بواسطة ER والميتوكوندريا ببداية الخلل الوظيفي العصبي في مرض الزهايمر ومرض باركنسون ومرض هنتنغتون 6,7.

تتطلب دراسة خلل التشوب Ca 2+ أثناء الشيخوخة الطبيعية أو التنكس العصبي الملاحظة الطولية لمستويات Ca2+ مع دقة تحت خلوية في كائن حي سليم يتم فيه الحفاظ على البنية الخلوية الأصلية (أي ترتيب نقاط الاشتباك العصبي وتوزيع القنوات الأيونية). تحقيقا لهذه الغاية ، يوفر هذا البروتوكول إرشادات حول استخدام مستشعرين Ca 2+ متاحين بسهولة ومشفرين وراثيا لتسجيل ديناميكيات Ca2+ في الجسم الحي بدقة مكانية وزمانية عالية. توضح النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام الطريقة الموصوفة في C. elegans كيف يمكن أن يسمح التعبير عن مؤشرات Ca 2+ في السيتوبلازم أو مصفوفة الميتوكوندريا للخلايا العصبية المفردة بالحصول السريع على صور الفلورسنت (حتى 50 هرتز) التي توضح ديناميكيات Ca 2+ مع القدرة الإضافية على تمييز مستويات Ca 2+ داخل هياكل تشبه العمود الفقري الفردي والميتوكوندريا الفردية.

Protocol

1. خلق سلالات معدلة وراثيا

  1. باستخدام طريقة الاستنساخ للاختيار 8,9 ، استنساخ متجهات التعبير لاحتواء مروج Pflp-18 أو Prig-3 (للإشارة الخاصة ب AVA في الحبل العصبي البطني) ، متبوعا بمؤشر Ca2+ المفضل ، ثم UTR 3 '(انظر المناقشة لمزيد من المعلومات)10. يمكن العثور على قائمة البلازميدات ومصادرها في الجدول التكميلي 1.
  2. اتبع البروتوكول المعمول به لإنشاء سلالات محورة وراثيا عن طريق الحقن المجهري لمزيج الحمض النووي (<100 نانوغرام / ميكرولتر ؛ انظر الجدول التكميلي 1 لتركيزات كل بلازميد) يحتوي على جين التحوير مؤشر Ca 2+ (~20 نانوغرام / ميكرولتر) والحمض النووي المنقذ lin-15+ (علامة الاختيار) في الغدد التناسلية لشخص بالغ يبلغ من العمر يوما واحدا C. elegans10 (النمط الجيني: لين -15 (N765TS) ؛ النمط الظاهري: متعدد الفرج)10,11.
    ملاحظه. الحفاظ على الآباء lin-15 (n765ts) عند 15 درجة مئوية لقمع الطفرة الحساسة لدرجة الحرارة.
  3. الحفاظ على الوالدين المحقونين عند 20 درجة مئوية حتى تصل ذرية F1 إلى مرحلة البلوغ للسماح بالانتقاء المعدل وراثيا باستخدام عدم وجود النمط الظاهري متعدد الفرج.
  4. الممرالنسيلي 13 ذرية F1 البالغة التي لا تحتوي على النمط الظاهري متعدد الفرج لأن هذا يشير إلى التعبير عن المصفوفة خارج الكروموسومات التي تحتوي على مؤشر Ca2+ 11.
  5. قم بتقييم التعبير عن مؤشر Ca2+ في ذرية F2 أو F3 التي لا تحتوي على النمط الظاهري متعدد الفرج عن طريق تركيب وتصوير البالغين بعمر يوم واحد كما هو موضح لاحقا في القسم 3.
    ملاحظه. مطلوب تعبير مرتفع نسبيا للمؤشر للحصول السريع على الصور كما هو موضح هنا (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل).
  6. إجراء تجارب على الأجيال اللاحقة من السلالات المحورة وراثيا مع التعبير الأمثل لمؤشر Ca 2+ (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل) ، والحفاظ على السلالات في ظل الظروف القياسية (20 درجة مئوية على ألواح NGM) 12.

2. الإعداد البصري

  1. استخدم مجهرا قادرا على التصوير بفاصل زمني طويل المدى.
    ملاحظه. تم الحصول على البيانات التمثيلية باستخدام مجهر متحد البؤر للقرص الدوار مقلوب مجهز بليزر إثارة 488 نانومتر و 561 نانومتر.
  2. استخدم هدف تكبير منخفض (أي 10x / 0.40) للتوطين الخام للدودة.
  3. لتحقيق دقة تحت خلوية ، قم بالتبديل إلى الخلايا العصبية وتحديد موقعها باستخدام هدف تكبير عالي.
    ملاحظه. تم استخدام هدف نفطي 100x / 1.40 NA للحصول على البيانات التمثيلية في هذه الدراسة.
  4. احصل على الصور باستخدام كاميرا فائقة الحساسية قادرة على التقاط الصور بسرعة (>50 إطارا في الثانية).
  5. استخدم مرشح انبعاث قياسي لمؤشر Ca2+ المفضل (على سبيل المثال ، مرشح انبعاثات 525 نانومتر ± 50 نانومتر ل GCaMP6f و mitoGCaMP).
  6. أضف مصحح الانجراف Z (ZDC) للحصول على تدفقات الصور التي تزيد عن 10 ثوان ، حيث يؤدي جفاف وسادة الآجار أثناء جلسة التصوير إلى انحراف الخلايا العصبية عن التركيز في غضون عدة ثوان.
    ملاحظه. إذا كان إعداد الفحص المجهري لا يسمح ب ZDC ، أو إذا كانت فترات التصوير الطويلة (>20 دقيقة) مطلوبة ، فقم بتطبيق حد من شحم السيليكون أو الفازلين المذاب حول وسادة الآجار لإبطاء الجفاف.

3. إعداد الديدان للتصوير

  1. تحضير منصات أجار
    1. اصنع 3 مل من أجار 10٪ عن طريق إذابة أجار الدرجة الجزيئية في M912 في أنبوب استزراع زجاجي 13 مم × 100 مم ووضعه في الميكروويف لعدة ثوان (انظر جدول المواد).
      ملاحظه. يمكن الاحتفاظ بالآجار المنصهر على كتلة حرارية لمدة تصل إلى 1 ساعة أو يمكن جعله طازجا في كل مرة تكون هناك حاجة إلى وسادات أجار.
    2. ضع شريحة مجهرية بين شريحتين إضافيتين لكل منهما طبقتان من شريط المختبر (انظر الشكل 1A-i).
    3. اقطع طرف طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر (بدون مرشح) ، واستخدمه لسحب قطرة صغيرة من الآجار على غطاء الغطاء المركزي (الشكل 1A-i).
    4. قم بتسطيح الآجار بالضغط على شريحة أخرى لأسفل أعلى الآجار (الشكل 1A-ii).
    5. بعد التبريد ، قم بقطع الآجار إلى قرص صغير باستخدام فتحة أنبوب ثقافة زجاجي 13 مم × 100 مم (الشكل 1A-iii) ، ثم قم بإزالة الأجار المحيط.
  2. تحضير محلول التدحرج الدودي
    1. قم بإذابة مسحوق موسيمول في M9 لإنشاء مخزون 30 مللي مول. تفصل إلى 50 ميكرولتر من القسامة، وتخزن على حرارة 4 درجات مئوية.
    2. قم بإذابة حصة جديدة من 30 mM muscimol كل 3-5 أيام (وتخزينها في درجة حرارة 20 درجة مئوية أثناء الاستخدام).
    3. قم بتخفيف مخزون 30 مللي متر من muscimol بنسبة 1: 1 باستخدام حبات البوليسترين لصنع محلول الدرفلة.
  3. وضع دودة للتصوير
    1. ضع 1.6 ميكرولتر من محلول الدرفلة في وسط وسادة أجار.
      ملاحظة: يجب ضبط كمية السائل لتصوير الحيوانات الأصغر سنا (أقل) أو الأكبر سنا (أكثر).
    2. باستخدام اختيار الدودة المفضل (أي معول سلك زجاجي أو بلاتيني)13 ، انقل دودة من العمر المطلوب بدون النمط الظاهري متعدد الفرج11 إلى محلول الدرفلة على وسادة أجار (الشكل 1A-IV).
      ملاحظه. البيانات التمثيلية مأخوذة من خنثى عمره يوم واحد (سلالة GCaMP6f = FJH185 ؛ سلالة mitoGCaMP. فجه 597; انظر الجدول التكميلي 1) ، والذي يمكن تحديده من خلال وجود صف واحد فقط من البيض. انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل حول العمل مع الديدان من مختلف الأعمار.
    3. انتظر ~ 5 دقائق حتى يقلل muscimol من حركة الدودة ، ثم قم بإسقاط غطاء 22 مم × 22 مم أعلى وسادة الآجار ، مما يقيد حركة الدودة جسديا.
    4. لتصوير الخلايا العصبية في الحبل العصبي البطني ، قم بلف الدودة في الاتجاه الموضح في الشكل 1B ، C عن طريق تحريك غطاء الغطاء برفق.
      ملاحظه. لتصور الحبل العصبي البطني ، ضع الدودة مع الرأس لأعلى ، ولف الدودة حتى تصبح الأمعاء على الجانب الأيمن من الجزء القريب واليسار للجزء البعيد من الدودة (من منظور المشاهد). عكس هذا الاتجاه (الشكل 1C) لتصوير الخلايا العصبية في الحبل العصبي الظهري.
  4. تركيب الدودة على المجهر
    1. ضع قطرة من زيت الغمر على غطاء الغطاء قبل تركيبه على مرحلة المجهر.
    2. ابحث عن الفيروس المتنقل باستخدام هدف تكبير منخفض (10x) في برايتفيلد.
    3. قم بالتبديل إلى هدف 100x ، واضبط التركيز.
    4. حدد موقع عصور AVA باستخدام إضاءة GCaMP أو mitoGCaMP باستخدام ليزر التصوير 488 نانومتر.
      ملاحظة: استخدم تعديلات صغيرة لمنع سحق الدودة أو سحب غطاء الغطاء.

4. الحصول على تدفقات صور عالية الدقة

  1. في الجسم الحي تصوير GCaMP
    1. اضبط وقت التعرض على 20 مللي ثانية.
    2. اضبط ليزر التصوير وإعدادات الاكتساب حتى يصبح مضان GCaMP الأساسي في النطاق المتوسط للنطاق الديناميكيللكاميرا 14. ارجع إلى المناقشة للحصول على اقتراحات حول تحسين معلمات التصوير باستخدام إعدادات الفحص المجهري الأخرى.
      ملاحظه. بالنسبة للإعداد البصري المستخدم في هذه الدراسة ، اضبط ليزر التصوير 488 نانومتر على إعدادات الإخراج التالية: طاقة الليزر = 50٪ والتوهين = 1. قم بتعديل إعدادات الاستحواذ الإضافية على النحو التالي: كسب EM = 200 وكسب مكبر الصوت المسبق = 1.
    3. بعد تحديد موقع عصور AVA باستخدام مضان GCaMP عند تكبير 100x ، اضبط ZDC (انظر جدول المواد) على نطاق ±30 ميكرومتر ، وابدأ التركيز التلقائي المستمر. قم بتصحيح المستوى البؤري يدويا حسب الحاجة قبل التصوير.
    4. احصل على دفق من الصور بتكبير 100x. يمكن تحقيق فترات تصل إلى 10 دقائق من خلال الإعداد المستخدم في هذه الدراسة.
  2. التصوير في الجسم الحي mitoGCaMP
    1. اتبع الخطوات 4.1.1-4.1.2 حسب الحاجة للحصول على مضان mitoGCaMP القاعدي في النطاق المتوسط للنطاق الديناميكيللكاميرا 14.
      ملاحظه. بالنسبة للإعداد البصري المستخدم في هذه الدراسة ، اضبط ليزر التصوير 488 نانومتر على إعدادات الإخراج التالية: طاقة الليزر = 20٪ والتوهين = 10. قم بتعديل إعدادات الاستحواذ إلى ما يلي: كسب EM = 100 وكسب مكبر الصوت المسبق = 2.
    2. بعد وضع الميتوكوندريا في عصفور AVA باستخدام مضان mitoGCaMP ، قم بتعيين ZDC كما هو موضح أعلاه في الخطوة 3.3.
    3. احصل على دفق من الصور بتكبير 100x.

5. تحليل تدفق الصور

  1. افتح تدفق الصور في برنامج صور مناسب لتحليل قيم البكسل في سلسلة صور (انظر جدول المواد).
  2. باستخدام أداة تحديد المضلع ، حدد منطقة الاهتمام دون الخلوية (ROI) التي تحتوي على GCaMP أو mitoGCaMP.
  3. انقر فوق تحليل أدوات > > مدير عائد الاستثمار. في مدير عائد الاستثمار، انقر على إضافة ثم على المزيد > القياس المتعدد. في نافذة القياس المتعدد، انقر فوق موافق لجمع متوسط والحد الأدنى والحد الأقصى لكثافة البكسل لعائد الاستثمار المحدد أعلاه لكل إطار من تدفق الصورة لمزيد من التحليل.
    ملاحظه. يوصى بتسوية متوسط كثافة البكسل (F avg) إلى الحد الأدنى للكثافة (F min) لكل عائد استثمار باستخدام النسبة Favg / Fmin لحساب الاختلافات الفلورية بسبب تحديد المواقع في المستوى z. تجاهل تدفقات الصور بحركة الدودة أثناء التصوير لأن هذا سيؤثر أيضا على قياسات التألق.

النتائج

يتيح هذان البروتوكولان الاكتساب السريع لمستويات Ca2+ التفاضلية داخل المناطق تحت الخلوية وعضيات الخلايا العصبية الفردية في الجسم الحي بدقة مكانية عالية. يسمح البروتوكول الأول بقياس السيتوبلازم Ca2+ بدقة زمنية ومكانية عالية. يتضح هذا هنا باستخدام التعبير الخاص بالخلية ل GCaMP6f...

Discussion

يتضمن الاعتبار الأول عند تنفيذ الطريقة الموضحة اختيار مؤشر Ca2+ بخصائص مثالية لسؤال البحث المحدد. عادة ما يكون لمؤشرات Ca 2+ السيتوبلازمية تقارب كبير مع Ca 2+ ، وترتبط حساسية هذه المؤشرات تجاه Ca2+ عكسيا بالحركية (معدل التشغيل / الإيقاف)16,17. ?...

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (R01- NS115947 الممنوحة ل F. Hoerndli). نود أيضا أن نشكر الدكتور أتيلا ستيتاك على بلازميد pAS1.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100x/1.40 Oil objective  Olympus  UPlanSApo
10x/0.40 Objective Olympus  UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass VWR 48366-227 
Agarose SFR VWR J234-100G 
Beam homogenizerAndor TechnologiesBorealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table TMC With vibration control
Disposable culture tubesVWR 47729-572 13 mm x 100 mm
Environmental chamberThermo Scientific3940Set to 20 °C
Filter wheel or sliderASIFor 25 mm diameter filters
FJH 185Caenorhabditis Genetics Center FJH 185Worm strain
FJH 597Caenorhabditis Genetics CenterFJH 597Worm strain
GFP bandpass emission filter Chroma 525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner Andor Technologies 4 laser lines 
ILE solid state 488 nm laserAndor Technologies 50 mW
ImageJNational Institutes of HealthVersion 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope Olympus With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera Andor Technologies 
Low auto-fluorescence immersion oil Olympus Z-81226
MetaMorph Molecular Devices Version 7.10.1 
Microscope control boxOlympusIX3-CBH
Muscimol MP Biomedical / Sigma02195336-CF 
pAS1AddGene194970Plasmid
pBSKSStratagene
pCT61Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1 AddGene 194969Plasmid
Polybead microspheres Polysciences Inc. 00876-15 0.094 µm
Stability chamberNorlake ScientificNSRI241WSW/8HSet to 15 °C
Stage controllerASIWith filter wheel control
Standard microscope slidePremiere9108W-E75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controllerOlympusI3-TPC
Z-drift corrector Olympus IX3-ZDC2

References

  1. Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).
  2. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  3. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Intracellular calcium homeostasis and signaling. Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).
  4. Berridge, M. J. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).
  5. Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. Calcium-handling defects and neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).
  6. Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
  7. Jadiya, P., et al. Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease. Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).
  8. Zeiser, E., Frøkjær-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline. PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).
  9. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
  10. Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook. , (2006).
  11. Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  13. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates. WormBook. , (2006).
  14. Ogama, T. A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy. The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).
  15. Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v. Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).
  16. Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. bioRxiv. , (2021).
  17. Kerruth, S., Coates, C., Dürst, C. D., Oertner, T. G., Török, K. The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators. Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).
  18. de Juan-Sanz, J., et al. Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals. Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).
  19. Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. Cell-type-specific promoters for C. elegans glia. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).
  20. Ali, F., Kwan, A. C. Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review. Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).
  21. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  22. Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
  23. Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. Improved deep two-photon calcium imaging in vivo. Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).
  24. Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction. Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).
  25. Yang, H. H., et al. Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
  26. Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. Active cortical dendrites modulate perception. Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).
  27. Nicoletti, M., et al. Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD. PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).
  28. Church, P. J., Stanley, E. F. Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).
  29. O'Hare, J. K., et al. Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release. Science. 375 (6586), (2022).
  30. Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans. Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).
  31. Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).
  32. Wu, J., et al. A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging. Nature Communications. 5, 5262 (2014).
  33. Cho, J. -. H., et al. The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
  34. Smith, J. J., et al. A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).
  35. Müller, M., et al. Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging. Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).
  36. Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Calcium homeostasis in aging neurons. Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).
  37. Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).
  38. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  39. Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans. Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved