Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Riepilogo

I metodi attuali descrivono un approccio non raziometrico per l'imaging subcompartimentale del calcio ad alta risoluzione in vivo in Caenorhabditis elegans utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati prontamente disponibili.

Abstract

L'imaging del calcio (Ca 2+) è stato ampiamente utilizzato per esaminare l'attività neuronale, ma sta diventando sempre più chiaro che la manipolazione subcellulare di Ca²⁺ è una componente cruciale della segnalazione intracellulare. La visualizzazione della dinamica subcellulare di Ca²⁺ in vivo, dove i neuroni possono essere studiati nei loro circuiti nativi e intatti, si è dimostrata tecnicamente impegnativa nei sistemi nervosi complessi. La trasparenza e il sistema nervoso relativamente semplice del nematode Caenorhabditis elegans consentono l'espressione cellula-specifica e la visualizzazione in vivo di tag e indicatori fluorescenti. Tra questi ci sono indicatori fluorescenti che sono stati modificati per l'uso nel citoplasma e vari compartimenti subcellulari, come i mitocondri. Questo protocollo consente l'imaging non raziometrico di Ca 2+ in vivo con una risoluzione subcellulare che consente l'analisi della dinamica di Ca²⁺ fino al livello delle singole spine dendritiche e dei mitocondri. Qui, due indicatori geneticamente codificati disponibili con diverse affinità Ca 2+ sono utilizzati per dimostrare l'uso di questo protocollo per misurare i livelli relativi di Ca²⁺ all'interno del citoplasma o della matrice mitocondriale in una singola coppia di interneuroni eccitatori (AVA). Insieme alle manipolazioni genetiche e alle osservazioni longitudinali possibili in C. elegans, questo protocollo di imaging può essere utile per rispondere a domande su come la manipolazione di Ca²⁺ regola la funzione neuronale e la plasticità.

Introduzione

Gli ioni calcio (Ca²⁺) sono vettori altamente versatili di informazioni in molti tipi di cellule. Nei neuroni, Ca²⁺ è responsabile del rilascio dipendente dall'attività dei neurotrasmettitori, della regolazione della motilità citoscheletrica, della messa a punto dei processi metabolici, nonché di molti altri meccanismi necessari per il corretto mantenimento e funzione neuronale ^1,2. Per garantire un'efficace segnalazione intracellulare, i neuroni devono mantenere bassi i livelli basali di Ca²⁺ nel loro citoplasma³. Ciò è ottenuto da meccanismi di manipolazione cooperativa di Ca 2+, incluso l'assorbimento di Ca²⁺ in organelli come il reticolo endoplasmatico (ER) e i mitocondri. Questi processi, oltre alla disposizione dei canali ionici permeabili al Ca 2+ nella membrana plasmatica, determinano livelli eterogenei di Ca²⁺ citoplasmatico in tutto il neurone.

L'eterogeneità di Ca 2+ durante il riposo e l'attivazione neuronale consente la regolazione diversificata e specifica della posizione dei meccanismi dipendenti da Ca^{2+ 1}. Un esempio degli effetti specifici della concentrazione di Ca 2+ è il rilascio di Ca²⁺ dall'ER attraverso i recettori dell'inositolo 1,4,5-trisfosfato (InsP₃). Bassi livelli di Ca²⁺ in combinazione con InsP₃ sono necessari per l'apertura del poro permeabile al calcio del recettore. In alternativa, alti livelli di Ca²⁺ inibiscono direttamente e indirettamente il recettore⁴. L'importanza dell'omeostasi del Ca 2+ per la corretta funzione neuronale è supportata da prove che suggeriscono che la manipolazione e la segnalazione intracellulare di Ca²⁺ è un passo iniziale nella patogenesi dei disturbi neurodegenerativi e dell'invecchiamento naturale ^5,6. In particolare, l'assorbimento e il rilascio anormali di Ca²⁺ da parte dell'ER e dei mitocondri sono legati all'insorgenza di disfunzioni neuronali nella malattia di Alzheimer, nel morbo di Parkinson e nella malattia di Huntington ^6,7.

Lo studio della disomeostasi di Ca 2+ durante l'invecchiamento naturale o la neurodegenerazione richiede l'osservazione longitudinale dei livelli di Ca²⁺ con risoluzione subcellulare in un organismo vivente e intatto in cui viene mantenuta l'architettura cellulare nativa (cioè la disposizione delle sinapsi e la distribuzione dei canali ionici). A tal fine, questo protocollo fornisce indicazioni sull'uso di due sensori Ca 2+ codificati geneticamente disponibili per la registrazione delle dinamiche Ca²⁺ in vivo con elevata risoluzione spaziale e temporale. I risultati rappresentativi acquisiti utilizzando il metodo descritto in C. elegans dimostrano come l'espressione di indicatori di Ca 2+ nel citoplasma o nella matrice mitocondriale di singoli neuroni possa consentire la rapida acquisizione di immagini fluorescenti (fino a 50 Hz) che illustrano la dinamica di Ca 2+ con la capacità aggiuntiva di discernere i livelli di Ca ²⁺ all'interno di singole strutture simili a spine e singoli mitocondri.

Protocollo

1. Creazione di ceppi transgenici

1. Utilizzando un metodo di clonazione a scelta^8,9, clonare vettori di espressione per contenere il promotore Pflp-18 o Prig-3 (per il segnale specifico AVA nel cordone nervoso ventrale), seguito dall'indicatore di scelta Ca^2+, e quindi un 3' UTR (vedere la discussione per maggiori informazioni)¹⁰. Un elenco dei plasmidi e delle loro fonti può essere trovato nella Tabella supplementare 1.
2. Seguire il protocollo stabilito per la creazione di ceppi transgenici tramite microiniezione di un mix di DNA (<100 ng/μL; vedere la Tabella supplementare 1 per le concentrazioni di ciascun plasmide) contenente il transgene indicatore Ca²+ (~20 ng/μL) e il DNA di salvataggio lin-15⁺ (marcatore di selezione) nella gonade di un adulto di 1 giorno C. elegans¹⁰ (genotipo: LIN-15 (N765TS); fenotipo: multi-vulva)^10,11.
   NOTA. Mantenere i genitori lin-15 (n765ts) a 15 °C per sopprimere la mutazione sensibile alla temperatura.
3. Mantenere i genitori iniettati a 20 °C fino a quando la progenie F1 raggiunge l'età adulta per consentire la selezione transgenica utilizzando l'assenza del fenotipo multi-vulva.
4. Passaggio clonale¹³ progenie adulta F1 che non ha il fenotipo multi-vulva in quanto ciò indica l'espressione dell'array extracromosomico contenente l'indicatore Ca^{2+ 11}.
5. Valutare l'espressione dell'indicatore Ca²⁺ nella progenie F2 o F3 che non ha il fenotipo multi-vulva montando e riprendendo gli adulti di 1 giorno come descritto più avanti nel paragrafo 3.
   NOTA. Un'espressione relativamente alta dell'indicatore è necessaria per l'acquisizione rapida delle immagini come descritto qui (vedere la discussione per maggiori dettagli).
6. Eseguire esperimenti sulle generazioni successive dei ceppi transgenici con un'espressione ottimale dell'indicatore Ca 2+ (vedere la discussione per maggiori dettagli), mantenendo i ceppi in condizioni standard (²⁰ °C su piastre NGM)¹².

2. Configurazione ottica

1. Utilizzare un microscopio in grado di imaging time-lapse a lungo termine.
   NOTA. I dati rappresentativi sono stati acquisiti utilizzando un microscopio confocale a disco rotante invertito dotato di laser di eccitazione a 488 nm e 561 nm.
2. Utilizzare un obiettivo a basso ingrandimento (cioè 10x/0,40) per la localizzazione approssimativa del worm.
3. Per ottenere la risoluzione subcellulare, passare e localizzare i neuroni utilizzando un obiettivo ad alto ingrandimento.
   NOTA. Un obiettivo di olio 100x/1.40 NA è stato utilizzato per acquisire i dati rappresentativi in questo studio.
4. Acquisisci le immagini utilizzando una fotocamera ultrasensibile in grado di acquisire rapidamente le immagini (>50 fps).
5. Utilizzare un filtro di emissione standard per l'indicatore di scelta Ca²⁺ (ad esempio, un filtro di emissione da 525 nm ± 50 nm per GCaMP6f e mitoGCaMP).
6. Aggiungere un correttore Z-drift (ZDC) per l'acquisizione di flussi di immagini più lunghi di 10 s, poiché l'essiccazione del pad di agar durante la sessione di imaging fa sì che il neurite vada fuori fuoco in pochi secondi.
   NOTA. Se una configurazione al microscopio non consente ZDC o se si desiderano lunghi periodi di imaging (>20 minuti), applicare un bordo di grasso al silicio o vaselina fusa attorno al tampone di agar per rallentare l'essiccazione.

3. Preparazione di vermi per l'imaging

1. Preparazione dei cuscinetti di agar
   1. Produrre 3 ml di agar al 10% sciogliendo l'agar di grado molecolare in M9¹² in un tubo di coltura di vetro da 13 mm x 100 mm e cuocendo al microonde per diversi secondi (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA. L'agar fuso può essere conservato su un blocco termico per un massimo di 1 ora o può essere reso fresco ogni volta che sono necessari cuscinetti di agar.
   2. Posizionare un vetrino da microscopio tra due vetrini aggiuntivi che hanno ciascuno due strati di nastro da laboratorio (vedere Figura 1A-i).
   3. Tagliare la punta di una punta di pipetta da 1.000 μL (senza filtro) e utilizzarla per pipettare una piccola goccia di agar sul coperchio centrale (Figura 1A-i).
   4. Appiattire l'agar premendo un altro scorrimento verso il basso sulla parte superiore dell'agar (Figura 1A-ii).
   5. Dopo il raffreddamento, tagliare l'agar in un piccolo disco usando l'apertura di un tubo di coltura di vetro di 13 mm x 100 mm (Figura 1A-iii), quindi rimuovere l'agar circostante.
2. Preparazione della soluzione di laminazione della vite senza fine
   1. Sciogliere la polvere di muscimolo in M9 per creare un brodo di 30 mM. Separare in aliquote da 50 μL e conservare a 4 °C.
   2. Scongelare una nuova aliquota di 30 mM di muscimolo ogni 3-5 giorni (e conservare a 20 °C durante l'uso).
   3. Diluire un brodo di muscimolo da 30 mM in rapporto 1:1 con perle di polistirolo per ottenere la soluzione di laminazione.
3. Posizionamento di un worm per l'imaging
   1. Introdurre 1,6 μL della soluzione di laminazione al centro del tampone di agar.
      NOTA: la quantità di liquido deve essere regolata per l'imaging degli animali più giovani (meno) o più anziani (più).
   2. Utilizzando il plettro a vite senza fine preferito (cioè un plettro di filo di vetro o di platino)¹³, trasferire un verme dell'età desiderata senza il fenotipo multi-vulva¹¹ nella soluzione di laminazione sul tampone di agar (Figura 1A-iv).
      NOTA. I dati rappresentativi provengono da ermafroditi di 1 giorno (ceppo GCaMP6f = FJH185; ceppo mitoGCaMP; FJH597; cfr. tabella supplementare 1), che può essere identificata dalla presenza di una sola fila di uova. Vedere la discussione per maggiori dettagli su come lavorare con vermi di età diverse.
   3. Attendere ~ 5 minuti affinché il muscimolo riduca il movimento del verme, quindi rilasciare una copertina di 22 mm x 22 mm sulla parte superiore del cuscinetto di agar, limitando fisicamente il movimento del verme.
   4. Per l'imaging dei neuriti nel cordone nervoso ventrale, far rotolare il verme nell'orientamento mostrato nella Figura 1B,C facendo scorrere leggermente il vetrino di copertura.
      NOTA. Per visualizzare il cordone nervoso ventrale, posizionare il verme con la testa verso l'alto e far rotolare il verme fino a quando l'intestino si trova sul lato destro della porzione prossimale e a sinistra per la porzione distale del verme (dal punto di vista dello spettatore). Invertire questo orientamento (Figura 1C) per l'imaging dei neuriti nel cordone nervoso dorsale.
4. Montaggio del verme su un microscopio
   1. Posizionare una goccia di olio ad immersione sul vetrino prima di montarlo sul palco del microscopio.
   2. Trova il worm usando un obiettivo a basso ingrandimento (10x) in campo chiaro.
   3. Passa all'obiettivo 100x e regola la messa a fuoco.
   4. Localizzare il neurite AVA utilizzando l'illuminazione di GCaMP o mitoGCaMP con il laser di imaging a 488 nm.
      NOTA: utilizzare piccole regolazioni per evitare di schiacciare il worm o di togliere il coperchio.

4. Acquisizione di flussi di immagini ad alta risoluzione

1. In vivo Imaging GCaMP
   1. Impostare il tempo di esposizione su 20 ms.
   2. Regolare le impostazioni del laser di imaging e dell'acquisizione fino a quando la fluorescenza basale GCaMP è nella gamma media della gamma dinamica¹⁴ della termocamera. Fare riferimento alla discussione per suggerimenti sull'ottimizzazione dei parametri di imaging utilizzando altre configurazioni di microscopia.
      NOTA. Per la configurazione ottica utilizzata in questo studio, impostare il laser di imaging a 488 nm sulle seguenti impostazioni di uscita: potenza laser = 50% e attenuazione = 1. Modificare le impostazioni di acquisizione aggiuntive come segue: guadagno EM = 200 e guadagno preamplificatore = 1.
   3. Dopo aver localizzato il neurite AVA utilizzando la fluorescenza GCaMP con ingrandimento 100x, impostare lo ZDC (vedere Tabella dei materiali) su un intervallo di ±30 μm e avviare l'autofocus continuo. Correggere manualmente il piano focale in base alle esigenze prima di eseguire l'imaging.
   4. Acquisisci un flusso di immagini con un ingrandimento di 100x. Durate fino a 10 minuti possono essere raggiunte con la configurazione utilizzata in questo studio.
2. Imaging mitoGCaMP in vivo
   1. Seguire i passaggi 4.1.1-4.1.2 secondo necessità per acquisire la fluorescenza basale mitoGCaMP nella gamma media per la gamma dinamica¹⁴ della telecamera.
      NOTA. Per la configurazione ottica utilizzata in questo studio, impostare il laser di imaging a 488 nm sulle seguenti impostazioni di uscita: potenza laser = 20% e attenuazione = 10. Modificare le impostazioni di acquisizione come segue: guadagno EM = 100 e guadagno preamplificatore = 2.
   2. Dopo che i mitocondri nel neurite AVA sono stati localizzati utilizzando la fluorescenza mitoGCaMP, impostare lo ZDC come descritto sopra nel passaggio 3.3.
   3. Acquisisci un flusso di immagini con un ingrandimento di 100x.

5. Analisi del flusso di immagini

1. Aprire il flusso di immagini in un software di immagine appropriato per analizzare i valori dei pixel in una serie di immagini (vedere Tabella dei materiali).
2. Utilizzando lo strumento Selezione poligono , definire la regione subcellulare di interesse (ROI) contenente GCaMP o mitoGCaMP.
3. Fai clic su Analizza > Tools > ROI Manager. In Gestione ROI, fai clic su Aggiungi e quindi su Altro > Multimisura. Nella finestra Multi misura, fate clic su OK per raccogliere automaticamente le intensità di pixel medie, minime e massime del ROI definito sopra per ogni fotogramma del flusso di immagini per ulteriori analisi.
   NOTA. Si consiglia di normalizzare l'intensità media dei pixel (F avg) all'intensità minima (F min) per ciascun ROI utilizzando il rapporto F_avg/F_min per tenere conto delle differenze di fluorescenza dovute al posizionamento nel piano z. Scartare i flussi di immagini con il movimento del verme durante l'imaging poiché ciò influenzerebbe anche le misurazioni della fluorescenza.

Risultati

Questi due protocolli consentono la rapida acquisizione di livelli differenziali di Ca²⁺ all'interno delle regioni subcellulari e degli organelli dei singoli neuriti in vivo con elevata risoluzione spaziale. Il primo protocollo consente la misurazione del Ca 2⁺ citoplasmatico con elevata risoluzione temporale e spaziale. Ciò è dimostrato qui utilizzando l'espressione cellula-specifica di GCaMP6f negli interneuroni¹⁵ del comando glutammatergico AVA, i cui neuriti pe...

Discussione

La prima considerazione quando si implementa il metodo descritto comporta la selezione di un indicatore Ca²⁺ con caratteristiche ideali per la domanda di ricerca data. Gli indicatori citoplasmatici di Ca 2+ hanno tipicamente un'alta affinità per Ca 2+ e la sensibilità di questi indicatori a Ca ²⁺ è inversamente correlata alla cinetica (on/off rate)^16,17. Ciò significa che la sensibilità o la cinetica di Ca²⁺

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x/1.40 Oil objective	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objective	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
Beam homogenizer	Andor Technologies		Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table	TMC		With vibration control
Disposable culture tubes	VWR	47729-572	13 mm x 100 mm
Environmental chamber	Thermo Scientific	3940	Set to 20 °C
Filter wheel or slider	ASI		For 25 mm diameter filters
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Worm strain
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Worm strain
GFP bandpass emission filter	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner	Andor Technologies		4 laser lines
ILE solid state 488 nm laser	Andor Technologies		50 mW
ImageJ	National Institutes of Health		Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope	Olympus		With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera	Andor Technologies
Low auto-fluorescence immersion oil	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Version 7.10.1
Microscope control box	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
pAS1	AddGene	194970	Plasmid
pBSKS	Stratagene
pCT61			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1	AddGene	194969	Plasmid
Polybead microspheres	Polysciences Inc.	00876-15	0.094 µm
Stability chamber	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Set to 15 °C
Stage controller	ASI		With filter wheel control
Standard microscope slide	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller	Olympus		I3-TPC
Z-drift corrector	Olympus		IX3-ZDC2