Субклеточная визуализация обработки кальция нейронами in vivo

Резюме

Современные методы описывают нератиометрический подход к субкомпартментной визуализации кальция с высоким разрешением in vivo у Caenorhabditis elegans с использованием легкодоступных генетически кодируемых индикаторов кальция.

Аннотация

Визуализация кальция (^Ca2+) в основном используется для изучения активности нейронов, но становится все более очевидным, что субклеточная обработка Ca²⁺ является важнейшим компонентом внутриклеточной передачи сигналов. Визуализация субклеточной динамики Ca²⁺ in vivo, где нейроны могут быть изучены в их нативной, интактной схеме, оказалась технически сложной в сложных нервных системах. Прозрачность и относительно простая нервная система нематоды Caenorhabditis elegans обеспечивают клеточно-специфическую экспрессию и визуализацию in vivo флуоресцентных меток и индикаторов. Среди них флуоресцентные индикаторы, которые были модифицированы для использования в цитоплазме, а также в различных субклеточных компартментах, таких как митохондрии. Этот протокол позволяет проводить нератиометрическую визуализацию^Ca2 + in vivo с субклеточным разрешением, что позволяет анализировать динамику Ca²⁺ вплоть до уровня отдельных дендритных шипов и митохондрий. Здесь используются два доступных генетически кодируемых индикатора с разным сродством к^Ca2 +, чтобы продемонстрировать использование этого протокола для измерения относительных уровней Ca²⁺ в цитоплазме или митохондриальном матриксе в одной паре возбуждающих интернейронов (AVA). Вместе с генетическими манипуляциями и продольными наблюдениями, возможными у C. elegans, этот протокол визуализации может быть полезен для ответа на вопросы о том, как обработка Ca²⁺ регулирует функцию и пластичность нейронов.

Введение

Ионы кальция (^Ca2+) являются универсальными носителями информации во многих типах клеток. В нейронах Ca²⁺ отвечает за зависящее от активности высвобождение нейротрансмиттеров, регуляцию подвижности цитоскелета, тонкую настройку метаболических процессов, а также за многие другие механизмы, необходимые для правильного поддержания и функционирования нейронов ^1,2. Чтобы обеспечить эффективную внутриклеточную передачу сигналов, нейроны должны поддерживать низкий базальный уровень Ca²⁺ в своей цитоплазме³. Это достигается совместными механизмами обработки Ca2+, включая поглощение Ca²⁺ органеллами, такими как эндоплазматический ретикулум (ER) и митохондрии. Эти процессы, в дополнение к расположению Ca 2+-проницаемых ионных каналов в плазматической мембране, приводят к гетерогенным уровням цитоплазматического Ca²⁺ по всему нейрону.

Гетерогенность^Ca2+ во время покоя и активации нейронов обеспечивает разнообразную, специфическую для местоположения регуляцию Ca²⁺-зависимых механизмов¹. Одним из примеров специфических для концентрации эффектов Ca 2+ является высвобождение Ca ²⁺ из ER через рецепторы инозитол-1,4,5-трисфосфата (InsP 3). Низкие уровни Ca²⁺ в сочетании с InsP₃ необходимы для открытия кальций-проницаемой поры рецептора. В качестве альтернативы, высокие уровни Ca²⁺ как прямо, так и косвенно ингибируют рецептор⁴. Важность гомеостаза Ca 2+ для правильной функции нейронов подтверждается данными, свидетельствующими о том, что нарушение внутриклеточной обработки и передачи сигналов Ca²⁺ является ранним шагом в патогенезе нейродегенеративных расстройств и естественного старения ^5,6. В частности, аномальное поглощение и высвобождение Ca²⁺ скорой помощью и митохондриями связано с началом дисфункции нейронов при болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и болезни Хантингтона ^6,7.

Изучение дисгомеостаза Са 2+ при естественном старении или нейродегенерации требует продольного наблюдения уровней Са²⁺ с субклеточным разрешением в живом, интактном организме, в котором поддерживается нативная клеточная архитектура (т. е. расположение синапсов и распределение ионных каналов). С этой целью этот протокол содержит рекомендации по использованию двух легкодоступных, генетически закодированных датчиков Ca 2+ для записи динамики Ca²⁺ in vivo с высоким пространственным и временным разрешением. Репрезентативные результаты, полученные с помощью описанного метода у C. elegans, демонстрируют, как экспрессия показателей Ca 2+ в цитоплазме или митохондриальном матриксе отдельных нейронов может позволить быстро получать флуоресцентные изображения (до 50 Гц), которые иллюстрируют динамику Ca 2+ с дополнительной способностью различать уровни Ca ²⁺ в отдельных позвоночных структурах и отдельных митохондриях.

протокол

1. Создание трансгенных штаммов

1. Используя метод клонирования^по выбору ^8,9, клонируйте векторы экспрессии, чтобы они содержали промотор Pflp-18 или Prig-3 (для AVA-специфического сигнала в вентральном нервном мозге), затем индикатор выбора Ca^2+, а затем 3'-UTR (см. обсуждение для получения дополнительной информации)¹⁰. Список плазмид и их источников можно найти в дополнительной таблице 1.
2. Следуйте установленному протоколу создания трансгенных штаммов путем микроинъекции смеси ДНК (<100 нг/мкл; см. Дополнительную таблицу 1 для концентраций каждой плазмиды), содержащей трансген-индикатор Ca 2+ (~²⁰ нг / мкл) и спасательную ДНК lin-15⁺ (маркер отбора) в гонаду 1-дневного взрослого C. elegans¹⁰ (генотип: ЛИН-15(Н765ТС); фенотип: мультивульва)^10,11.
   ЗАМЕТКА. Поддерживайте родителей lin-15 (n765ts) при 15 ° C, чтобы подавить чувствительную к температуре мутацию.
3. Поддерживайте инъецированных родителей при температуре 20 ° C до тех пор, пока потомство F1 не достигнет совершеннолетия, чтобы обеспечить трансгенный отбор с использованием отсутствия фенотипа с несколькими вульвами.
4. Клональное прохождение¹³ взрослого потомства F1, не имеющего фенотипа мультивульвы, так как это указывает на экспрессию внехромосомного массива, содержащего показатель Ca^{2+ 11}.
5. Оцените экспрессию показателя Ca²⁺ у потомства F2 или F3, у которых нет фенотипа с несколькими вульвами, путем установки и визуализации взрослых в возрасте 1 дня, как описано далее в разделе 3.
   ЗАМЕТКА. Для быстрого получения изображений, как описано здесь, требуется относительно высокая экспрессия индикатора (см. обсуждение для более подробной информации).
6. Проведение экспериментов на последующих поколениях трансгенных штаммов с оптимальной экспрессией показателя^Ca2+ (подробнее см. обсуждение), поддерживая штаммы в стандартных условиях (20 °C на планшетах NGM)¹².

2. Оптическая настройка

1. Используйте микроскоп, способный к длительной покадровой съемке.
   ЗАМЕТКА. Репрезентативные данные были получены с помощью конфокального микроскопа с инвертированным вращающимся диском, оснащенного лазерами возбуждения 488 нм и 561 нм.
2. Используйте объектив с малым увеличением (т. е. 10x/0,40) для грубой локализации червя.
3. Чтобы достичь субклеточного разрешения, переключитесь на нейроны и локализуйте их, используя объектив с большим увеличением.
   ЗАМЕТКА. Для получения репрезентативных данных в этом исследовании был использован объектив 100x/1,40 NA oil.
4. Получайте изображения с помощью сверхчувствительной камеры, способной быстро получать изображения (>50 кадров в секунду).
5. Используйте стандартный эмиссионный фильтр для выбранного индикатора Ca²⁺ (т. е. эмиссионный фильтр 525 нм ± 50 нм для GCaMP6f и mitoGCaMP).
6. Добавьте корректор Z-дрейфа (ZDC) для получения потоков изображений продолжительностью более 10 с, так как высыхание агаровой прокладки во время сеанса визуализации приводит к тому, что нейрит выходит из фокуса в течение нескольких секунд.
   ЗАМЕТКА. Если установка микроскопии не позволяет проводить ZDC или если желательны длительные (>20 минут) периоды визуализации, нанесите границу силиконовой смазки или расплавленного вазелина вокруг агаровой прокладки, чтобы замедлить высыхание.

3. Подготовка глистов к визуализации

1. Подготовка агаровых подушечек
   1. Сделайте 3 мл 10% агара, растворив молекулярный агар в M9¹² в стеклянной пробирке для культивирования размером 13 мм x 100 мм и разогрев в микроволновой печи в течение нескольких секунд (см. Таблицу материалов).
      ЗАМЕТКА. Расплавленный агар можно хранить на тепловом блоке до 1 часа или делать свежим каждый раз, когда требуются агаровые прокладки.
   2. Поместите предметное стекло микроскопа между двумя дополнительными предметными стеклами, каждое из которых имеет два слоя лабораторной ленты (см. рис. 1A-i).
   3. Отрежьте наконечник наконечника пипетки объемом 1,000 мкл (без фильтра) и используйте его, чтобы нанести небольшую каплю агара на центральное покровное стекло (рис. 1A-i).
   4. Разровняйте агар, нажав еще один слайд вниз поверх агара (рис. 1A-ii).
   5. После охлаждения нарежьте агар на небольшой диск, используя отверстие стеклянной пробирки для культивирования размером 13 мм x 100 мм (рис. 1A-iii), а затем удалите окружающий агар.
2. Приготовление червячного раствора
   1. Растворите порошок мусцимола в M9, чтобы получить запас 30 мМ. Разделить на аликвоты по 50 мкл и хранить при температуре 4 °C.
   2. Размораживайте новую аликвоту 30 мМ мусцимола каждые 3-5 дней (и храните при температуре 20 ° C во время использования).
   3. Разбавьте мусцимол 30 мМ в соотношении 1:1 гранулами полистирола, чтобы получить раствор для прокатки.
3. Позиционирование червя для визуализации
   1. Поместите 1.6 мкл раскатывающего раствора в центр агаровой подушечки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество жидкости должно быть скорректировано для визуализации молодых (меньше) или пожилых животных (больше).
   2. Используя предпочтительный червячный медиатор (т.е. медиатор из стеклянной или платиновой проволоки)¹³, перенесите червя желаемого возраста без фенотипа¹¹ с несколькими вульвами в рулонный раствор на агаровой подушечке (рис. 1A-iv).
      ЗАМЕТКА. Репрезентативные данные получены от гермафродитов возрастом 1 день (штамм GCaMP6f = FJH185; штамм mitoGCaMP; FJH597; см. Дополнительную таблицу 1), которые могут быть идентифицированы по наличию только одного ряда яиц. Подробнее о работе с глистами разного возраста смотрите в обсуждении.
   3. Подождите ~ 5 минут, пока мусцимол уменьшит движение червя, а затем бросьте покровное стекло размером 22 мм x 22 мм поверх агаровой подушечки, физически ограничивая движение червя.
   4. Для визуализации нейритов в вентральном нервном мозге сверните червя в ориентацию, показанную на рисунке 1B, C, слегка сдвинув покровное стекло.
      ЗАМЕТКА. Чтобы визуализировать вентральный нервный тяж, расположите червя головой вверх и катите червя, пока кишечник не окажется с правой стороны проксимальной части, а левой - с дистальной части червя (с точки зрения зрителя). Инвертируйте эту ориентацию (рис. 1C) для визуализации нейритов в дорсальном нервном мозге.
4. Установка червя на микроскоп
   1. Нанесите каплю иммерсионного масла на покровное стекло, прежде чем устанавливать его на предметный столик микроскопа.
   2. Найдите червя с помощью объектива с малым увеличением (10x) в светлом поле.
   3. Переключитесь на 100-кратный объектив и отрегулируйте фокусировку.
   4. Определите местонахождение нейрита AVA с помощью подсветки GCaMP или mitoGCaMP с помощью лазера визуализации с длиной волны 488 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте небольшие регулировки, чтобы предотвратить раздавливание червя или снятие покровного стекла.

4. Получение потоков изображений с высоким разрешением

1. В естественных условиях Визуализация GCaMP
   1. Установите время экспозиции 20 мс.
   2. Отрегулируйте настройки лазера и съемки до тех пор, пока базальная флуоресценция GCaMP не достигнет среднего диапазона динамического диапазона^{камеры 14}. Обратитесь к обсуждению для получения предложений по оптимизации параметров визуализации с использованием других установок микроскопии.
      ЗАМЕТКА. Для оптической установки, используемой в этом исследовании, установите лазер визуализации с длиной волны 488 нм на следующие выходные настройки: мощность лазера = 50% и затухание = 1. Измените дополнительные настройки сбора данных следующим образом: усиление ЭМ = 200 и усиление предварительного усилителя = 1.
   3. После того, как нейрит AVA будет обнаружен с помощью флуоресценции GCaMP при 100-кратном увеличении, установите ZDC (см. Таблицу материалов) в диапазон ±30 мкм и инициируйте непрерывную автофокусировку. Перед получением изображения вручную скорректируйте фокальную плоскость по мере необходимости.
   4. Получение потока изображений со 100-кратным увеличением. Продолжительность до 10 минут может быть достигнута с помощью установки, используемой в этом исследовании.
2. Визуализация in vivo mitoGCaMP
   1. Выполните шаги 4.1.1-4.1.2 по мере необходимости, чтобы получить базальную флуоресценцию mitoGCaMP в среднем диапазоне для динамического диапазона^{камеры 14}.
      ЗАМЕТКА. Для оптической установки, используемой в этом исследовании, установите лазер визуализации с длиной волны 488 нм на следующие выходные настройки: мощность лазера = 20% и затухание = 10. Измените настройки сбора данных следующим образом: усиление ЭМ = 100 и усиление предварительного усилителя = 2.
   2. После того, как митохондрии в нейрите AVA будут расположены с помощью флуоресценции mitoGCaMP, установите ZDC, как описано выше на шаге 3.3.
   3. Получение потока изображений со 100-кратным увеличением.

5. Анализ потока изображений

1. Откройте поток изображений в соответствующем программном обеспечении для анализа значений пикселей в серии изображений (см. Таблицу материалов).
2. С помощью инструмента « Выделение многоугольника » определите интересующую субклеточную область (ROI), содержащую GCaMP или mitoGCaMP.
3. Нажмите « Инструменты анализа >» > ROI Manager. В диспетчере рентабельности инвестиций нажмите кнопку Добавить , а затем Дополнительно > Мультимера. В окне «Мультимера» нажмите кнопку «ОК», чтобы автоматически получить среднюю, минимальную и максимальную интенсивность окупаемости инвестиций в пикселях, определенную выше для каждого кадра потока изображения для дальнейшего анализа.
   ЗАМЕТКА. Рекомендуется, чтобы средняя интенсивность пикселей (F_{средняя}) нормализовалась до минимальной интенсивности (F min) для каждого ROI с использованием отношения F_{среднего} / F_min для учета различий флуоресценции из-за позиционирования в z-плоскости. Откажитесь от потоков изображения с червячным движением во время визуализации, так как это также повлияет на измерения флуоресценции.

Результаты

Эти два протокола позволяют быстро получать дифференциальные уровни Ca²⁺ в субклеточных областях и органеллах отдельных нейритов in vivo с высоким пространственным разрешением. Первый протокол позволяет измерять цитоплазматический Ca²⁺ с высоким временным и пространствен...

Обсуждение

Первое соображение при реализации описанного метода связано с выбором показателя Ca²⁺ с идеальными характеристиками для данного вопроса исследования. Цитоплазматические показатели Ca2+ обычно имеют высокое сродство к Ca2+, а чувствительность этих показателей к^Ca2+ обратн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x/1.40 Oil objective	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objective	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
Beam homogenizer	Andor Technologies		Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table	TMC		With vibration control
Disposable culture tubes	VWR	47729-572	13 mm x 100 mm
Environmental chamber	Thermo Scientific	3940	Set to 20 °C
Filter wheel or slider	ASI		For 25 mm diameter filters
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Worm strain
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Worm strain
GFP bandpass emission filter	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner	Andor Technologies		4 laser lines
ILE solid state 488 nm laser	Andor Technologies		50 mW
ImageJ	National Institutes of Health		Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope	Olympus		With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera	Andor Technologies
Low auto-fluorescence immersion oil	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Version 7.10.1
Microscope control box	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
pAS1	AddGene	194970	Plasmid
pBSKS	Stratagene
pCT61			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1	AddGene	194969	Plasmid
Polybead microspheres	Polysciences Inc.	00876-15	0.094 µm
Stability chamber	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Set to 15 °C
Stage controller	ASI		With filter wheel control
Standard microscope slide	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller	Olympus		I3-TPC
Z-drift corrector	Olympus		IX3-ZDC2