Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Özet

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Özet

Kalsiyum (Ca 2 +) görüntüleme, nöronal aktiviteyi incelemek için büyük ölçüde kullanılmıştır, ancak hücre altı Ca^{2 +} kullanımının hücre içi sinyallemenin çok önemli bir bileşeni olduğu giderek daha açık hale gelmektedir. Nöronların yerli, bozulmamış devrelerinde incelenebildiği hücre altı^{Ca2 +} dinamiklerinin in vivo olarak görselleştirilmesi, karmaşık sinir sistemlerinde teknik olarak zor olduğunu kanıtlamıştır. Nematodun Caenorhabditis elegans'ın saydamlığı ve nispeten basit sinir sistemi, floresan etiketlerinin ve göstergelerinin hücreye özgü ekspresyonunu ve in vivo görselleştirilmesini sağlar. Bunlar arasında, sitoplazmada ve mitokondri gibi çeşitli hücre altı bölmelerde kullanılmak üzere modifiye edilmiş floresan göstergeler bulunmaktadır. Bu protokol, Ca 2⁺ dinamiklerinin bireysel dendritik dikenler ve mitokondri seviyesine kadar analizine izin veren bir hücre altı çözünürlükle in vivo olarak orantısız Ca^{2 +} görüntülemeyi mümkün kılar. Burada, farklı Ca 2 + afinitelerine sahip iki mevcut genetik olarak kodlanmış gösterge, bu protokolün tek bir uyarıcı internöron çiftinde (AVA) sitoplazma veya mitokondriyal matris içindeki göreceli Ca^{2 +} seviyelerini ölçmek için kullanımını göstermek için kullanılır. C. elegans'ta mümkün olan genetik manipülasyonlar ve uzunlamasına gözlemlerle birlikte, bu görüntüleme protokolü, Ca2⁺ kullanımının nöronal fonksiyonu ve plastisiteyi nasıl düzenlediğine ilişkin soruları cevaplamak için yararlı olabilir.

Giriş

Kalsiyum iyonları (Ca²⁺), birçok hücre tipinde çok yönlü bilgi taşıyıcılarıdır. Nöronlarda, Ca²⁺, nörotransmitterlerin aktiviteye bağlı salınımından, sitoiskelet motilitesinin düzenlenmesinden, metabolik süreçlerin ince ayarından ve ayrıca uygun nöronal bakım ve fonksiyon ^1,2 için gerekli diğer birçok mekanizmadan sorumludur. Etkili hücre içi sinyalleşmeyi sağlamak için, nöronlar sitoplazma^3'lerinde düşük bazal Ca^{2 +} seviyelerini korumalıdır. Bu, Ca^{2 +} 'nın endoplazmik retikulum (ER) ve mitokondri gibi organellere alımı da dahil olmak üzere işbirlikçi Ca^{2 +} taşıma mekanizmaları ile gerçekleştirilir. Bu işlemler, plazma zarındaki^Ca2 + geçirgen iyon kanallarının düzenlenmesine ek olarak, nöron boyunca heterojen sitoplazmik Ca^{2 +} seviyelerine neden olur.

Dinlenme ve nöronal aktivasyon sırasında Ca 2 + heterojenliği, Ca^{2 +} bağımlı mekanizmaların çeşitli, yere özgü düzenlenmesine izin verir¹. Ca 2 + 'nın konsantrasyona özgü etkilerinin bir örneği, Ca^{2 +} 'nın ER'den inositol 1,4,5-trisfosfat (InsP₃) reseptörleri yoluyla salınmasıdır. Reseptörün kalsiyum geçirgen gözeneklerinin açılması için InsP₃ ile kombinasyon halinde düşük Ca^{2 +} seviyeleri gereklidir. Alternatif olarak, yüksek Ca^{2 +} seviyeleri hem doğrudan hem de dolaylı olarak reseptör^4'ü inhibe eder. ^Ca2+ homeostazının uygun nöronal fonksiyon için önemi, bozulmuş hücre içi Ca²⁺ kullanımı ve sinyalizasyonunun nörodejeneratif bozuklukların ve doğal yaşlanmanın patogenezinde erken bir adım olduğunu gösteren kanıtlarla desteklenmektedir ^5,6. Spesifik olarak, ER ve mitokondri tarafından anormal Ca^{2 +} alımı ve salınımı Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı ve Huntington hastalığı ^6,7'de nöronal disfonksiyonun başlangıcı ile bağlantılıdır.

Doğal yaşlanma veya nörodejenerasyon sırasında Ca 2⁺ dishomeostazının incelenmesi, doğal hücresel mimarinin (yani, sinapsların düzenlenmesi ve iyon kanallarının dağılımı) korunduğu canlı, sağlam bir organizmada hücre altı çözünürlükle Ca^{2 +} seviyelerinin uzunlamasına gözlemlenmesini gerektirir. Bu amaçla, bu protokol, Ca 2+ dinamiklerini yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle in vivo olarak kaydetmek için kolayca bulunabilen, genetik olarak kodlanmış iki Ca²⁺ sensörünün kullanımı konusunda rehberlik sağlar. C. elegans'ta tarif edilen yöntem kullanılarak elde edilen temsili sonuçlar, tek nöronların sitoplazmasında veya mitokondriyal matrisinde^Ca2+ göstergelerinin ekspresyonunun, tek omurga benzeri yapılar ve bireysel mitokondri içindeki Ca²⁺ seviyelerini ayırt etme yeteneği ile Ca^{2 +} dinamiklerini gösteren floresan görüntülerin (50 Hz'e kadar) hızlı bir şekilde elde edilmesine nasıl izin verebileceğini göstermektedir.

Protokol

1. Transgenik suşların oluşturulması

1. ^{Tercih edilen 8,9} klonlama yöntemini kullanarak^, Pflp-18 veya Prig-3 promotörünü (ventral sinir kordonundaki AVA'ya özgü sinyal için), ardından tercih edilen Ca²⁺ göstergesini ve ardından 3' UTR'yi (daha fazla bilgi için tartışmaya bakın) içerecek şekilde ekspresyon vektörlerini klonlayın10. Plazmidlerin ve kaynaklarının bir listesi Ek Tablo 1'de bulunabilir.
2. Ca 2+ indikatör transgeni (~²⁰ ng / μL) ve kurtarma DNA lin-15 ⁺ (seçim belirteci) içeren bir DNA karışımının (<100 ng / μL; her plazmidin konsantrasyonları için Ek Tablo 1'e bakınız) 1 günlük yetişkin C. elegans^10'un gonadına mikroenjeksiyonu yoluyla transgenik suşların oluşturulması için belirlenmiş protokolü izleyin (genotip: Lin-15 (N765TS); Fenotip: Multi-vulva)^10,11.
   NOT. Sıcaklığa duyarlı mutasyonu bastırmak için lin-15 (n765ts) ebeveynlerini 15 ° C'de tutun.
3. Enjekte edilen ebeveynleri, çoklu vulva fenotipinin yokluğunu kullanarak transgenik seçime izin vermek için F1 soyu yetişkinliğe ulaşana kadar 20 ° C'de tutun.
4. Klonal olarak geçiş: Çok vulva fenotipine sahip olmayan¹³ yetişkin F1 soyundan, Ca^{2 +} göstergesi^11'i içeren ekstrakromozomal dizinin ekspresyonunu gösterir.
5. Çoklu-vulva fenotipine sahip olmayan F2 veya F3 döllerindeki Ca²⁺ göstergesinin ekspresyonunu, bölüm 3'te daha sonra açıklandığı gibi 1 günlük yetişkinleri monte ederek ve görüntüleyerek değerlendirin.
   NOT. Burada açıklandığı gibi görüntülerin hızlı bir şekilde elde edilmesi için göstergenin nispeten yüksek bir ifadesi gereklidir (daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakın).
6. Ca 2+ göstergesinin optimal bir ifadesiyle transgenik suşların sonraki nesilleri üzerinde deneyler yapın (daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakın), suşları standart koşullar altında (NGM plakalarında²⁰ °C) ^koruyun12.

2. Optik kurulum

1. Uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme yapabilen bir mikroskop kullanın.
   NOT. Temsili veriler, 488 nm ve 561 nm uyarma lazerleri ile donatılmış ters eğirme diskli konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi.
2. Solucanın ham lokalizasyonu için düşük büyütme hedefi (yani, 10x/0,40) kullanın.
3. Hücre altı çözünürlük elde etmek için, yüksek büyütmeli bir hedef kullanarak nöronlara geçin ve onları lokalize edin.
   NOT. Bu çalışmada temsili verileri elde etmek için 100x/1.40 NA petrol hedefi kullanılmıştır.
4. Hızlı görüntü yakalama (>50 fps) özelliğine sahip ultra hassas bir kamera kullanarak görüntüleri elde edin.
5. Tercih edilen Ca²⁺ göstergesi için standart bir emisyon filtresi kullanın (yani, GCaMP6f ± mitoGCaMP için 525 nm 50 nm emisyon filtresi).
6. Görüntüleme seansı sırasında agar pedinin kuruması nöritin birkaç saniye içinde odak dışına kaymasına neden olduğundan, 10 saniyeden daha uzun görüntü akışlarının elde edilmesi için bir Z-sürüklenme düzelticisi (ZDC) ekleyin.
   NOT. Bir mikroskopi kurulumu ZDC'ye izin vermiyorsa veya uzun (>20 dakika) görüntüleme periyotları isteniyorsa, kurutmayı yavaşlatmak için agar pedinin etrafına bir silikon yağ veya erimiş petrol jölesi sınırı uygulayın.

3. Görüntüleme için solucanların hazırlanması

1. Agar pedlerinin hazırlanması
   1. M9^12'deki moleküler dereceli agar'ı 13 mm x 100 mm'lik bir cam kültür tüpünde çözerek ve birkaç saniye boyunca mikrodalgada pişirerek 3 mL% 10 agar yapın (bkz.
      NOT. Erimiş agar, 1 saate kadar bir ısı bloğunda tutulabilir veya agar pedlerine her ihtiyaç duyulduğunda taze hale getirilebilir.
   2. Her biri iki laboratuvar bandı katmanına sahip iki ek slaytın arasına bir mikroskop slaydı yerleştirin (bkz. Şekil 1A-i).
   3. 1.000 μL'lik pipet ucunun ucunu kesin (filtresiz) ve orta kapak kaymasına küçük bir damla agar damlası damlatmak için kullanın (Şekil 1A-i).
   4. Agarın üstüne başka bir sürgü bastırarak agar'ı düzleştirin (Şekil 1A-ii).
   5. Soğuduktan sonra, 13 mm x 100 mm'lik bir cam kültür tüpünün açıklığını kullanarak agar'ı küçük bir disk halinde kesin (Şekil 1A-iii) ve ardından çevreleyen agar'ı çıkarın.
2. Sonsuz haddeleme çözeltisinin hazırlanması
   1. 30 mM'lik bir stok oluşturmak için mussimol tozunu M9'da çözün. 50 μL aliquots'a ayırın ve 4 °C'de saklayın.
   2. Her 3-5 günde bir 30 mM mussimol'lük yeni bir alikotu çözün (ve kullanımdayken 20 ° C'de saklayın).
   3. Haddeleme çözeltisini yapmak için 30 mM'lik bir mussimol stoğunu polistiren boncuklarla 1: 1 oranında seyreltin.
3. Solucanı görüntüleme için konumlandırma
   1. Haddeleme çözeltisinin 1,6 μL'sini agar pedinin ortasına yerleştirin.
      NOT: Genç (daha az) veya daha yaşlı (daha fazla) hayvanların görüntülenmesi için sıvı miktarı ayarlanmalıdır.
   2. Tercih edilen solucan toplama (yani bir cam veya platin tel toplama)¹³ kullanarak, multi-vulva fenotip¹¹ olmadan istenen yaştaki bir solucanı agar pedi üzerindeki yuvarlanma çözeltisine aktarın (Şekil 1A-iv).
      NOT. Temsili veriler 1 günlük hermafroditlerden (GCaMP6f suşu = FJH185; mitoGCaMP suşu; FJH597; Ek Tablo 1'e bakınız), sadece bir sıra yumurtanın varlığı ile tanımlanabilir. Farklı yaşlardaki solucanlarla çalışma hakkında daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakın.
   3. Mussimolün solucan hareketini azaltması için ~ 5 dakika bekleyin ve ardından solucan hareketini fiziksel olarak kısıtlayan agar pedinin üzerine 22 mm x 22 mm'lik bir örtü kayması bırakın.
   4. Ventral sinir kordonundaki nöritleri görüntülemek için, solucanı Şekil 1B, C'de gösterilen yöne doğru yuvarlayın.
      NOT. Ventral sinir kordonunu görselleştirmek için, solucanı baş yukarı doğru olacak şekilde konumlandırın ve solucanı bağırsak proksimal kısmın sağ tarafında ve solucanın distal kısmı için solda olana kadar yuvarlayın (izleyicinin bakış açısından). Dorsal sinir kordonundaki nöritleri görüntülemek için bu oryantasyonu tersine çevirin (Şekil 1C).
4. Solucanı mikroskop üzerine monte etme
   1. Mikroskop aşamasına monte etmeden önce kapak kapağına bir damla daldırma yağı koyun.
   2. Parlak alanda düşük büyütme hedefi (10x) hedefini kullanarak solucanı bulun.
   3. 100x reklam verme amacına geçin ve odağı ayarlayın.
   4. 488 nm görüntüleme lazeri ile GCaMP veya mitoGCaMP'nin aydınlatmasını kullanarak AVA nöritini bulun.
      NOT: Solucanın ezilmesini veya kapak kaymasının çekilmesini önlemek için küçük ayarlamalar kullanın.

4. Yüksek çözünürlüklü görüntü akışlarının elde edilmesi

1. İn vivo GCaMP görüntüleme
   1. Maruz kalma süresini 20 ms olarak ayarlayın.
   2. Bazal GCaMP floresan kameranın dinamik aralığının orta aralığında olana kadar görüntüleme lazeri ve alma ayarlarını yapın¹⁴. Diğer mikroskopi kurulumlarını kullanarak görüntüleme parametrelerini optimize etme önerileri için tartışmaya bakın.
      NOT. Bu çalışmada kullanılan optik kurulum için, 488 nm görüntüleme lazerini aşağıdaki çıkış ayarlarına ayarlayın: lazer gücü =% 50 ve zayıflama = 1. Ek alım ayarlarını şu şekilde değiştirin: EM kazancı = 200 ve ön amplifikatör kazancı = 1.
   3. AVA nöriti GCaMP floresan kullanılarak 100x büyütmede konumlandırıldıktan sonra, ZDC'yi ( bkz. Malzeme Tablosu) ±30 μm aralığına ayarlayın ve sürekli otomatik netlemeyi başlatın. Görüntülemeden önce odak düzlemini gerektiği gibi manuel olarak düzeltin.
   4. 100x büyütmede bir görüntü akışı elde edin. Bu çalışmada kullanılan kurulum ile 10 dakikaya varan süreler elde edilebilmektedir.
2. İn vivo mitoGCaMP görüntüleme
   1. Kameranın dinamik aralığı¹⁴ için orta aralıkta bazal mitoGCaMP floresansını elde etmek üzere gerektiği gibi 4.1.1-4.1.2 adımlarını izleyin.
      NOT. Bu çalışmada kullanılan optik kurulum için, 488 nm görüntüleme lazerini aşağıdaki çıkış ayarlarına ayarlayın: lazer gücü =% 20 ve zayıflama = 10. Alma ayarlarını şu şekilde değiştirin: EM kazancı = 100 ve ön amplifikatör kazancı = 2.
   2. AVA nöritindeki mitokondri mitoGCaMP floresan kullanılarak yerleştirildikten sonra, ZDC'yi yukarıda adım 3.3'te açıklandığı gibi ayarlayın.
   3. 100x büyütmede bir görüntü akışı elde edin.

5. Görüntü akışı analizi

1. Bir görüntü serisindeki piksel değerlerini analiz etmek için görüntü akışını uygun bir görüntü yazılımında açın (bkz.
2. Poligon Seçim aracını kullanarak, GCaMP veya mitoGCaMP içeren hücre altı ilgi alanını (ROI) tanımlayın.
3. ROI Manager'> > Araçlarını Analiz Et'e tıklayın. ROI Yöneticisi'nde, Ekle'ye ve ardından Çoklu Ölçüm > Fazlası'na tıklayın. Çoklu Ölçüm penceresinde, daha fazla analiz için görüntü akışının her karesi için yukarıda tanımlanan YG'nin ortalama, minimum ve maksimum piksel yoğunluklarını otomatik olarak toplamak üzere Tamam'ı tıklatın.
   NOT. Ortalama piksel yoğunluğunun (F_ort), z düzlemindeki konumlandırmadan kaynaklanan floresan farklılıklarını hesaba katmak için F_avg/F dak oranı kullanılarak her ROI için minimum yoğunluğa (F_dak) normalleştirilmesi önerilir. Görüntüleme sırasında solucan hareketi olan görüntü akışlarını atın, çünkü bu floresan ölçümlerini de etkileyecektir.

Sonuçlar

Bu iki protokol, hücre altı bölgelerde ve bireysel nöritlerin organellerinde diferansiyel^{Ca2 +} seviyelerinin in vivo olarak yüksek uzamsal çözünürlükle hızlı bir şekilde elde edilmesini sağlar. İlk protokol, yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlükte sitoplazmik Ca^{2 +} 'nın ölçülmesine izin verir. Bu, burada, nöritleri ventral sinir kordonunun tüm uzunluğunu çalıştıran glutamaterjik AVA komutu internöronlar^15'teki GCaMP6f'nin hücreye öz...

Tartışmalar

Açıklanan yöntemi uygularken göz önünde bulundurulması gereken ilk husus, verilen araştırma sorusu için ideal özelliklere sahip bir Ca²⁺ göstergesinin seçilmesini içerir. Sitoplazmik Ca 2+ göstergeleri tipik olarak Ca²⁺ için yüksek bir afiniteye sahiptir ve bu göstergelerin Ca^{2 +} 'ya duyarlılığı kinetik (açma / kapama oranı) ile ters orantılıdır ^16,17. Bu, Ca²⁺ duyarlılığının v...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x/1.40 Oil objective	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objective	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
Beam homogenizer	Andor Technologies		Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table	TMC		With vibration control
Disposable culture tubes	VWR	47729-572	13 mm x 100 mm
Environmental chamber	Thermo Scientific	3940	Set to 20 °C
Filter wheel or slider	ASI		For 25 mm diameter filters
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Worm strain
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Worm strain
GFP bandpass emission filter	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner	Andor Technologies		4 laser lines
ILE solid state 488 nm laser	Andor Technologies		50 mW
ImageJ	National Institutes of Health		Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope	Olympus		With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera	Andor Technologies
Low auto-fluorescence immersion oil	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Version 7.10.1
Microscope control box	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
pAS1	AddGene	194970	Plasmid
pBSKS	Stratagene
pCT61			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1	AddGene	194969	Plasmid
Polybead microspheres	Polysciences Inc.	00876-15	0.094 µm
Stability chamber	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Set to 15 °C
Stage controller	ASI		With filter wheel control
Standard microscope slide	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller	Olympus		I3-TPC
Z-drift corrector	Olympus		IX3-ZDC2