体内神经元钙处理的亚细胞成像

摘要

目前的方法描述了一种非比率方法，使用现成的遗传编码钙指示剂在秀丽隐杆线虫中进行高分辨率、亚区室钙成像。

摘要

钙（Ca 2+）成像已主要用于检查神经元活动，但越来越清楚的是，亚细胞Ca²⁺处理是细胞内信号传导的关键组成部分。体内亚细胞Ca²⁺动力学的可视化，其中神经元可以在其天然的完整回路中研究，已被证明在复杂的神经系统中具有技术挑战性。线虫秀丽隐杆线虫的透明度和相对简单的神经系统能够实现荧光标签和指示剂的细胞特异性表达和体内可视化。其中包括已被修饰用于细胞质以及各种亚细胞区室（例如线粒体）的荧光指示剂。该协议能够以亚细胞分辨率在体内进行非比率Ca 2 +成像，从而可以分析Ca^{2 +}动力学，直至单个树突棘和线粒体的水平。在这里，使用具有不同Ca 2 +亲和力的两个可用的遗传编码指示剂来证明使用该协议测量单对兴奋性中间神经元（AVA）中细胞质或线粒体基质内的相对Ca^{2 +}水平。结合秀丽隐杆线虫中可能的遗传操作和纵向观察，该成像方案可能有助于回答有关Ca^{2 +}处理如何调节神经元功能和可塑性的问题。

引言

钙离子（Ca²⁺）是许多细胞类型中高度通用的信息载体。在神经元中，Ca²⁺负责神经递质的活动依赖性释放，细胞骨架运动的调节，代谢过程的微调，以及适当的神经元维持和功能所需的许多其他机制^1，2。为了确保有效的细胞内信号传导，神经元必须在其细胞质^中保持较低的基础Ca²⁺水平3。这是通过合作的Ca 2+处理机制实现的，包括将Ca²⁺摄取到细胞器中，例如内质网（ER）和线粒体。除了在质膜中排列Ca 2+渗透离子通道外，这些过程还导致整个神经元中细胞质Ca²⁺的异质水平。

休息和神经元激活期间的Ca 2+异质性允许对Ca ²⁺依赖机制进行多种的，位置特异性的调节1。Ca 2+浓度特异性作用的一个例子是通过肌醇1，4，5-三磷酸（InsP₃）受体从ER释放Ca²⁺。低 Ca²⁺ 水平与 InsP₃ 相结合是打开受体的钙渗透性孔所必需的。或者，高Ca²⁺水平直接或间接抑制受体⁴。Ca 2+稳态对正常神经元功能的重要性得到了证据的支持，表明细胞内Ca ²⁺处理和信号传导中断是神经退行性疾病和自然衰老发病机制的早期步骤5^，6。具体来说，ER和线粒体的异常Ca²⁺摄取和释放与阿尔茨海默病，帕金森病和亨廷^顿病6，7的神经元功能障碍的发作有关。

研究自然衰老或神经变性过程中的Ca 2+稳态失调需要纵向观察活的，完整的生物体中具有亚细胞分辨率的Ca²⁺水平，其中天然细胞结构（即突触的排列和离子通道的分布）得以维持。为此，该协议为使用两种现成的基因编码Ca 2+传感器以高空间和时间分辨率记录体内Ca ²⁺动力学提供了指导。在秀丽隐杆线虫中使用所述方法获得的代表性结果表明，单个神经元的细胞质或线粒体基质中Ca 2+指示剂的表达如何允许快速获取荧光图像（高达50 Hz），这些荧光图像说明了Ca 2+动力学，并具有识别单个脊柱样结构和单个线粒体内Ca ²⁺水平的额外能力。

研究方案

1. 创造转基因菌株

1. 使用选择^的克隆方法8，^9，克隆表达载体以包含Pflp-18或Prig-3启动子（用于腹侧神经索中的AVA特异性信号），然后选择Ca²⁺指示剂，然后是3' UTR（有关更多信息，请参阅讨论）¹⁰。质粒及其来源的列表可在补充表1中找到。
2. 遵循既定的方案，通过显微注射含有Ca²+指示剂转基因（~20ng/μL）和拯救DNAlin-15⁺（选择标记）的DNA混合物（<100ng/μL;每个质粒的浓度参见补充表1）来创建转基因菌株，将其释放到1日龄成年秀丽隐杆线虫¹⁰（基因型: 林-15（N765TS）;表型:多外阴）^10，11。
   注意。将 lin-15（n765ts） 亲本保持在15°C以抑制温度敏感突变。
3. 将注射的父母维持在20°C，直到F1后代成年，以允许使用不存在多外阴表型进行转基因选择。
4. 克隆传代¹³ 个没有多外阴表型的成年F1后代，因为这表明含有Ca²⁺ 指示剂¹¹的染色体外阵列的表达。
5. 通过安装和成像 1 日龄成人来评估 Ca²⁺ 指示剂在没有多外阴表型的 F2 或 F3 后代中的表达，如第 3 节后面所述。
   注意。如本文所述，快速采集图像需要相对较高的指标表达式（有关更多详细信息，请参阅讨论）。
6. 对具有Ca 2+指示剂最佳表达的后续转基因菌株进行实验（有关更多详细信息，请参阅讨论），将菌株保持在标准条件下（NGM板上为²⁰ °C）¹²。

2. 光学设置

1. 使用能够进行长期延时成像的显微镜。
   注意。使用配备488 nm和561 nm激发激光器的倒转盘共聚焦显微镜获取代表性数据。
2. 使用低倍率物镜（即10x/0.40）对蠕虫进行粗略定位。
3. 为了达到亚细胞分辨率，使用高倍率物镜切换到并定位神经元。
   注意。使用100x/1.40 NA油物镜获取本研究中的代表性数据。
4. 使用能够快速图像采集（>50 fps）的超灵敏相机获取图像。
5. 对所选的Ca²⁺ 指示剂使用标准发射滤光片（即，用于GCaMP6f和mitoGCaMP的525 nm±50 nm发射滤光片）。
6. 添加Z漂移校正器（ZDC）用于采集长度超过10秒的图像流，因为在成像过程中琼脂垫的干燥会导致神经突在几秒钟内偏离焦点。
   注意。如果显微镜设置不允许ZDC，或者如果需要较长（>20分钟）的成像周期，则在琼脂垫周围应用硅脂或熔化的凡士林边界以减缓干燥。

3. 成像蠕虫的制备

1. 准备琼脂垫
   1. 通过将分子级琼脂溶解在 M9^{12 中的 13} mm x 100 mm 玻璃培养管中并微波数秒，制备 3 mL 的 10% 琼脂（参见 材料表）。
      注意。熔融琼脂可以在加热块上保持长达1小时，或者每次需要琼脂垫时都可以新鲜。
   2. 将显微镜载玻片放在两个额外的载玻片之间，每个载玻片都有两层实验室胶带（见图1A-i）。
   3. 切开 1，000 μL 移液器吸头（不带过滤器）的尖端，并用它来将一小滴琼脂移液到中心盖玻片上（图 1A-i）。
   4. 通过在琼脂顶部向下按压另一张幻灯片来压平琼脂（图1A-ii）。
   5. 冷却后，使用13mm x 100mm玻璃培养管的开口将琼脂切成小圆盘（图1A-iii），然后去除周围的琼脂。
2. 准备蠕虫滚动解决方案
   1. 将麝香酚粉末溶解在M9中以产生30 mM储备液。分离成50μL等分试样，并储存在4°C。
   2. 每3-5天解冻30mM麝香酚的新等分试样（并在使用时储存在20°C）。
   3. 用聚苯乙烯珠以 1:1 的比例稀释 30 mM 麝香酚原液，制成滚动溶液。
3. 定位蠕虫以进行成像
   1. 将 1.6 μL 滚动溶液放在琼脂垫的中心。
      注意:应调整液体量以成像年轻（较少）或年长的动物（更多）。
   2. 使用首选的蠕虫镐（即玻璃或铂丝镐）¹³，将没有多外阴表型¹¹ 的所需年龄的蠕虫转移到琼脂垫上的滚动溶液中（图1A-iv）。
      注意。代表性数据来自1日龄雌雄同体（GCaMP6f菌株= FJH185; 有丝分裂GCaMP菌株;FJH597;见 补充表1），这可以通过仅存在一排卵来识别。有关处理不同年龄的蠕虫的更多详细信息，请参阅讨论。
   3. 等待~5分钟，让Muscimol减少蠕虫运动，然后将22mm x 22mm盖玻片放在琼脂垫的顶部，物理限制蠕虫运动。
   4. 对于腹侧神经索中的神经突成像，通过轻轻滑动盖玻片将蠕虫滚动到 图1B，C 所示的方向。
      注意。要可视化腹侧神经索，请将蠕虫头部向上放置，然后滚动蠕虫，直到肠道位于蠕虫近端的右侧，左侧为蠕虫的远端部分（从观察者的角度来看）。反转此方向（图1C）以对背神经索中的神经突进行成像。
4. 将蠕虫安装在显微镜上
   1. 将一滴浸油滴在盖玻片上，然后将其安装到显微镜载物台上。
   2. 使用明场中的低放大倍率物镜（10倍）物镜找到蠕虫。
   3. 切换到100倍物镜，然后调整对焦。
   4. 使用 GCaMP 或 mitoGCaMP 的照明和 488 nm 成像激光定位 AVA 神经突。
      注意:使用小的调整以防止挤压蠕虫或拉下盖玻片。

4. 高分辨率图像流的采集

1. 体内 GCaMP 成像
   1. 将曝光时间设置为 20 毫秒。
   2. 调整成像激光和采集设置，直到基础GCaMP荧光处于相机动态范围¹⁴的中间范围内。有关使用其他显微镜设置优化成像参数的建议，请参阅讨论。
      注意。对于本研究中使用的光学设置，将488 nm成像激光器设置为以下输出设置:激光功率= 50%，衰减= 1。修改其他采集设置，如下所示:EM增益= 200，前置放大器增益= 1。
   3. 使用 GCaMP 荧光以 100 倍放大倍率定位 AVA 神经突后，将 ZDC（参见 材料表）设置为 ±30 μm 的范围，然后启动连续自动对焦。成像前根据需要手动校正焦平面。
   4. 以 100 倍放大倍率获取图像流。使用本研究中使用的设置可以实现长达 10 分钟的持续时间。
2. 体内 有丝分裂GCaMP成像
   1. 根据需要按照步骤4.1.1-4.1.2获取相机动态范围¹⁴的中距离基础有丝分裂GCaMP荧光。
      注意。对于本研究中使用的光学设置，将 488 nm 成像激光器设置为以下输出设置:激光功率 = 20%，衰减 = 10。将采集设置修改为以下内容:EM增益= 100，前置放大器增益= 2。
   2. 使用mitoGCaMP荧光定位AVA神经突中的线粒体后，按照上述步骤3.3中所述设置ZDC。
   3. 以 100 倍放大倍率获取图像流。

5. 图像流分析

1. 在适当的图像软件中打开图像流，以分析图像系列中的像素值（请参阅 材料表）。
2. 使用 多边形选择 工具，定义包含 GCaMP 或 mitoGCaMP 的亚细胞感兴趣区域 （ROI）。
3. 单击ROI 管理器>分析>工具。在 ROI 管理器中，单击 添加 ，然后单击 更多>多度量。在"多测量"窗口中，单击 "确定 "以自动收集上面为图像流的每一帧定义的 ROI 的平均、最小和最大像素强度，以便进一步分析。
   注意。建议使用比率F avg/F min将每个ROI的平均像素强度（F_avg）归一化为最小强度（F_min），以考虑由于在z平面中定位引起的荧光差异。在成像过程中丢弃蠕虫移动的图像流，因为这也会影响荧光测量。

结果

这两种方案能够以高空间分辨率快速获取体内单个神经突的亚细胞区域和细胞器内的差异Ca²⁺水平。第一个方案允许以高时间和空间分辨率测量细胞质Ca²⁺。这里使用谷氨酸能AVA命令中间神经元¹⁵中GCaMP6f的细胞特异性表达来证明这一点，其神经突贯穿腹侧神经索的整个长度。GCaMP6f荧光（50 Hz）的快速采集能够检测Ca 2⁺流入的方向传播（...

讨论

实施所述方法时的第一个考虑因素涉及为给定的研究问题选择具有理想特性的Ca²⁺指标。细胞质Ca 2+指示剂通常对Ca 2+具有高亲和力，这些指示剂对Ca ²⁺的敏感性与动力学（开/关速率）成反比¹⁶，¹⁷。这意味着需要根据感兴趣的现象优先考虑Ca²⁺灵敏度或动力学。对于具有相对较高的基础Ca 2+水平的亚细胞区室，例如E...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x/1.40 Oil objective	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objective	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
Beam homogenizer	Andor Technologies		Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table	TMC		With vibration control
Disposable culture tubes	VWR	47729-572	13 mm x 100 mm
Environmental chamber	Thermo Scientific	3940	Set to 20 °C
Filter wheel or slider	ASI		For 25 mm diameter filters
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Worm strain
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Worm strain
GFP bandpass emission filter	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner	Andor Technologies		4 laser lines
ILE solid state 488 nm laser	Andor Technologies		50 mW
ImageJ	National Institutes of Health		Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope	Olympus		With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera	Andor Technologies
Low auto-fluorescence immersion oil	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Version 7.10.1
Microscope control box	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
pAS1	AddGene	194970	Plasmid
pBSKS	Stratagene
pCT61			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1	AddGene	194969	Plasmid
Polybead microspheres	Polysciences Inc.	00876-15	0.094 µm
Stability chamber	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Set to 15 °C
Stage controller	ASI		With filter wheel control
Standard microscope slide	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller	Olympus		I3-TPC
Z-drift corrector	Olympus		IX3-ZDC2