생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

요약

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

초록

칼슘(^Ca2+) 이미징은 뉴런 활동을 조사하는 데 주로 사용되어 왔지만, 세포내^Ca2+ 처리가 세포내 신호전달의 중요한 구성 요소라는 것이 점점 더 분명해지고 있습니다. 생체 내에서 세포 내 Ca²⁺ 역학의 시각화는 뉴런이 원래의 온전한 회로에서 연구될 수 있으며, 복잡한 신경계에서 기술적으로 어려운 것으로 입증되었습니다. 선충 Caenorhabditis elegans의 투명성과 비교적 단순한 신경계는 형광 태그 및 지표의 세포 특이적 발현 및 생체 내 시각화를 가능하게 합니다. 이들 중에는 세포질뿐만 아니라 미토콘드리아와 같은 다양한 세포 내 구획에서 사용하도록 변형 된 형광 지표가 있습니다. 이 프로토콜은 개별 수지상 가시 및 미토콘드리아 수준까지 Ca 2+ 역학을 분석할 수 있는 세포 내 분해능으로 생체 내에서 비비율계량 Ca²⁺ 이미징을 가능하게 합니다. 여기서, 상이한 Ca²+ 친화도를 갖는 2개의 이용가능한 유전적으로 암호화된 지표가 단일 쌍의 흥분성 중간 뉴런 (AVA)에서 세포질 또는 미토콘드리아 매트릭스 내의 상대적^Ca2+ 수준을 측정하기 위한 이 프로토콜의 사용을 입증하기 위해 사용된다. 예쁜꼬마선충에서 가능한 유전자 조작 및 종단 관찰과 함께 이 이미징 프로토콜은 Ca²⁺ 처리가 신경 기능과 가소성을 조절하는 방법에 관한 질문에 답하는 데 유용할 수 있습니다.

서문

칼슘 이온(^Ca2+)은 많은 세포 유형에서 매우 다재다능한 정보 전달체입니다. 뉴런에서,^Ca2+는 신경전달물질의 활성-의존적 방출, 세포골격 운동성의 조절, 대사 과정의 미세 조정, 그리고 적절한 뉴런 유지와 기능에 필요한 다른 많은 기전을 담당한다 ^1,2. 효과적인 세포내 신호전달을 보장하기 위해, 뉴런은 세포질에서 낮은 기저 Ca²⁺ 수준을 유지해야 한다³. 이것은 소포체(ER) 및 미토콘드리아와 같은 세포 기관으로의 Ca²⁺ 흡수를 포함하는 협력적 Ca²⁺ 처리 메커니즘에 의해 달성됩니다. 이러한 과정은, 원형질막에서 Ca2+-투과성 이온 채널의 배열에 더하여, 뉴런 전체에 걸쳐 이질적인 수준의 세포질^Ca2+를 초래한다.

휴지기 및 뉴런 활성화 동안 Ca2+ 이질성은^Ca2+-의존적 메카니즘의 다양한, 위치-특이적^{조절을 허용}한다1. ^Ca2+의 농도-특이적 효....

프로토콜

1. 형질전환 균주 생성

1. 선택^8,9의 클로닝 방법을 사용하여, 발현 벡터를 복제하여 Pflp-18 또는 Prig-3 프로모터(복부 신경줄의 AVA 특이적 신호에 대해), 선택의^Ca2+ 지표^, 그 다음 3' UTR(자세한 내용은 논의 참조)¹⁰. 플라스미드 및 그 공급원의 목록은 보충 표 1에서 찾을 수 있습니다.
2. Ca 2+ 지표 이식유전자(~20ng/μL) 및 구조 DNA lin-15⁺(선택 마커)를 포함하는 DNA 믹스(<100ng/μL, 각 플라스미드의 농도는 보충 표 1 참조)를 통해 형질전환 균주를 생성하기 위해 확립된 프로토콜을 따르십시오. 린-15(N765TS); 표현형: 다중 외음부)^10,11.
   메모. lin-....

결과

이 두 가지 프로토콜은 높은 공간 분해능으로 생체 내 개별 신경돌기의 세포 내 영역 및 세포 기관 내에서 차등 Ca²⁺ 수준을 빠르게 획득할 수 있도록 합니다. 첫 번째 프로토콜은 높은 시간적 및 공간적 분해능으로 세포질^Ca2+의 측정을 허용합니다. 이것은 신경돌기가 복부 신경줄의 전체 길이를 달리는 글루타메이트성 AVA 명령 중간 뉴런¹⁵에서 GCaMP6f의 세포.......

토론

설명된 방법을 구현할 때 첫 번째 고려 사항은 주어진 연구 질문에 대해 이상적인 특성을 가진^Ca2+ 지표를 선택하는 것입니다. 세포질 Ca2+ 지표는 전형적으로 Ca2+에 대해 높은 친화도를 가지며,^Ca2+에 대한 이들 지표의 민감도는 동역학(on/off rate)^16,17과 반비례한다. 이는 Ca²⁺ 감도 또는 동역학이 관심 현상에 따라 우.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x/1.40 Oil objective	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objective	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
Beam homogenizer	Andor Technologies		Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table	TMC		With vibration control
Disposable culture tubes	VWR	47729-572	13 mm x 100 mm
Environmental chamber	Thermo Scientific	3940	Set to 20 °C
Filter wheel or slider	ASI		For 25 mm diameter filters
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Worm strain
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Worm strain
GFP bandpass emission filter	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner	Andor Technologies		4 laser lines
ILE solid state 488 nm laser	Andor Technologies		50 mW
ImageJ	National Institutes of Health		Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope	Olympus		With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera	Andor Technologies
Low auto-fluorescence immersion oil	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Version 7.10.1
Microscope control box	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
pAS1	AddGene	194970	Plasmid
pBSKS	Stratagene
pCT61			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1	AddGene	194969	Plasmid
Polybead microspheres	Polysciences Inc.	00876-15	0.094 µm
Stability chamber	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Set to 15 °C
Stage controller	ASI		With filter wheel control
Standard microscope slide	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller	Olympus		I3-TPC
Z-drift corrector	Olympus		IX3-ZDC2