Imagerie subcellulaire de la manipulation neuronale du calcium in vivo

Résumé

Les méthodes actuelles décrivent une approche non ratiométrique pour l’imagerie calcique sous-compartimentale à haute résolution in vivo chez Caenorhabditis elegans à l’aide d’indicateurs de calcium génétiquement codés facilement disponibles.

Résumé

L’imagerie calcique (Ca 2+) a été largement utilisée pour examiner l’activité neuronale, mais il devient de plus en plus clair que la manipulation subcellulaire du Ca²⁺ est un élément crucial de la signalisation intracellulaire. La visualisation de la dynamique subcellulaire Ca²⁺ in vivo, où les neurones peuvent être étudiés dans leurs circuits natifs intacts, s’est avérée techniquement difficile dans des systèmes nerveux complexes. La transparence et le système nerveux relativement simple du nématode Caenorhabditis elegans permettent l’expression spécifique de la cellule et la visualisation in vivo de marqueurs fluorescents et d’indicateurs. Parmi ceux-ci figurent des indicateurs fluorescents qui ont été modifiés pour être utilisés dans le cytoplasme ainsi que dans divers compartiments subcellulaires, tels que les mitochondries. Ce protocole permet l’imagerie non ratiométrique Ca 2+ in vivo avec une résolution subcellulaire qui permet l’analyse de la dynamique Ca²⁺ jusqu’au niveau des épines dendritiques individuelles et des mitochondries. Ici, deux indicateurs génétiquement codés disponibles avec des affinités Ca 2+ différentes sont utilisés pour démontrer l’utilisation de ce protocole pour mesurer les niveaux relatifs de Ca²⁺ dans le cytoplasme ou la matrice mitochondriale dans une seule paire d’interneurones excitateurs (AVA). Avec les manipulations génétiques et les observations longitudinales possibles chez C. elegans, ce protocole d’imagerie peut être utile pour répondre aux questions sur la façon dont la manipulation du Ca²⁺ régule la fonction neuronale et la plasticité.

Introduction

Les ions calcium (Ca²⁺) sont des vecteurs d’information très polyvalents dans de nombreux types de cellules. Dans les neurones, Ca²⁺ est responsable de la libération dépendante de l’activité des neurotransmetteurs, de la régulation de la motilité cytosquelettique, du réglage fin des processus métaboliques, ainsi que de nombreux autres mécanismes nécessaires au bon entretien et au bon fonctionnement^{neuronal 1,2}. Pour assurer une signalisation intracellulaire efficace, les neurones doivent maintenir de faibles niveaux basaux de Ca²⁺ dans leur cytoplasme³. Ceci est accompli par des mécanismes coopératifs de manipulation du Ca 2+, y compris l’absorption de Ca²⁺ dans des organites tels que le réticulum endoplasmique (RE) et les mitochondries. Ces processus, en plus de l’arrangement des canaux ioniques perméables Ca 2+ dans la membrane plasmique, entraînent des niveaux hétérogènes de Ca²⁺ cytoplasmique dans tout le neurone.

L’hétérogénéité Ca 2+ pendant le repos et l’activation neuronale permet la régulation diversifiée et spécifique à l’emplacement des mécanismes dépendants de Ca ²⁺ 1. Un exemple des effets spécifiques à la concentration de Ca 2+ est la libération de Ca ²⁺ du RE par les récepteurs de l’inositol 1,4,5-trisphosphate (InsP 3). De faibles niveaux de Ca²⁺ en combinaison avec InsP₃ sont nécessaires pour l’ouverture du pore perméable au calcium du récepteur. Alternativement, des niveaux élevés de Ca²⁺ inhibent directement et indirectement le récepteur⁴. L’importance de l’homéostasie Ca 2+ pour la fonction neuronale appropriée est étayée par des preuves suggérant que la manipulation et la signalisation intracellulaires du Ca²⁺ perturbées constituent une étape précoce de la pathogenèse des troubles neurodégénératifs et du vieillissement naturel ^5,6. Plus précisément, l’absorption et la libération anormales de Ca²⁺ par le RE et les mitochondries sont liées à l’apparition d’un dysfonctionnement neuronal dans la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington ^6,7.

L’étude de la dyshoméostasie Ca 2+ au cours du vieillissement naturel ou de la neurodégénérescence nécessite l’observation longitudinale des niveaux de Ca²⁺ avec une résolution subcellulaire dans un organisme vivant et intact dans lequel l’architecture cellulaire native (c’est-à-dire la disposition des synapses et la distribution des canaux ioniques) est maintenue. À cette fin, ce protocole fournit des conseils sur l’utilisation de deux capteurs Ca 2+ génétiquement codés facilement disponibles pour enregistrer la dynamique Ca²⁺ in vivo avec une résolution spatiale et temporelle élevée. Les résultats représentatifs obtenus à l’aide de la méthode décrite chez C. elegans démontrent comment l’expression des indicateurs Ca 2+ dans le cytoplasme ou la matrice mitochondriale de neurones individuels peut permettre l’acquisition rapide d’images fluorescentes (jusqu’à 50 Hz) qui illustrent la dynamique Ca 2+ avec la capacité supplémentaire de discerner les niveaux de Ca ²⁺ dans des structures semblables à une seule colonne vertébrale et des mitochondries individuelles.

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Protocole

1. Création de souches transgéniques

1. En utilisant une méthode de clonage de choix^8,9, cloner des vecteurs d’expression pour contenir le promoteur Pflp-18 ou Prig-3 (pour le signal spécifique à AVA dans le cordon nerveux ventral), suivi de l’indicateur Ca²⁺ de choix^, puis d’un UTR 3' (voir la discussion pour plus d’informations)¹⁰. Une liste des plasmides et de leurs sources se trouve dans le tableau supplémentaire 1.
2. Suivre le protocole établi pour la création de souches transgéniques par microinjection d’un mélange d’ADN (<100 ng/μL; voir le tableau supplémentaire 1 pour les concentrations de chaque plasmide) contenant le transgène indicateur Ca²+ (~20 ng/μL) et l’ADN de secours lin-15⁺ (marqueur de sélection) dans la gonade d’un adulte de 1 jour C. elegans¹⁰ (génotype: lin-15(N765TS); phénotype: multi-vulve)^10,11.
   NOTE. Maintenir les parents de la lignée 15(n765ts) à 15 °C pour supprimer les mutations sensibles à la température.
3. Maintenir les parents injectés à 20 °C jusqu’à ce que la descendance F1 atteigne l’âge adulte pour permettre une sélection transgénique en utilisant l’absence du phénotype multi-vulvaire.
4. Passage clonal¹³ descendants adultes F1 qui n’ont pas le phénotype multi-vulve car cela indique l’expression du réseau extrachromosomique contenant l’indicateur Ca^{2+ 11}.
5. Évaluer l’expression de l’indicateur Ca²⁺ dans la descendance F2 ou F3 qui n’a pas le phénotype multi-vulve en montant et en imageant des adultes âgés de 1 jour, comme décrit plus loin dans la section 3.
   NOTE. Une expression relativement élevée de l’indicateur est requise pour l’acquisition rapide d’images comme décrit ici (voir la discussion pour plus de détails).
6. Effectuer des expériences sur les générations suivantes de souches transgéniques avec une expression optimale de l’indicateur Ca 2+ (voir la discussion pour plus de détails), en maintenant les souches dans des conditions standard (²⁰ °C sur plaques NGM)¹².

2. Configuration optique

1. Utilisez un microscope capable d’imager en accéléré à long terme.
   NOTE. Les données représentatives ont été acquises à l’aide d’un microscope confocale à disque rotatif inversé équipé de lasers d’excitation de 488 nm et 561 nm.
2. Utilisez un objectif de faible grossissement (c.-à-d. 10x/0,40) pour la localisation brute du ver.
3. Pour obtenir une résolution subcellulaire, passez et localisez les neurones à l’aide d’un objectif de grossissement élevé.
   NOTE. Un objectif de pétrole 100x/1,40 NA a été utilisé pour acquérir les données représentatives de cette étude.
4. Acquérir les images à l’aide d’une caméra ultra-sensible capable d’acquérir rapidement des images (>50 ips).
5. Utilisez un filtre antipollution standard pour l’indicateur Ca²⁺ de votre choix (c.-à-d. un filtre antipollution de 525 nm ± 50 nm pour GCaMP6f et mitoGCaMP).
6. Ajoutez un correcteur Z-drift (ZDC) pour l’acquisition de flux d’images de plus de 10 s, car la dessiccation du tampon de gélose pendant la séance d’imagerie provoque la dérive floue du neurite en quelques secondes.
   NOTE. Si une installation de microscopie ne permet pas le ZDC, ou si de longues périodes d’imagerie (>20 min) sont souhaitées, appliquez une bordure de graisse de silicium ou de vaseline fondue autour du tampon de gélose pour ralentir la dessiccation.

3. Préparation des vers pour l’imagerie

1. Préparation des tampons d’agar
   1. Préparer 3 mL de gélose à 10 % en dissolvant de la gélose de qualité moléculaire dans M9¹² dans un tube de culture en verre de 13 mm x 100 mm et en faisant passer au micro-ondes pendant plusieurs secondes (voir le tableau des matières).
      NOTE. La gélose fondue peut être conservée sur un bloc thermique jusqu’à 1 h ou peut être préparée fraîche chaque fois que des tampons d’agar sont nécessaires.
   2. Placez une lame de microscope entre deux lames supplémentaires comportant chacune deux couches de ruban de laboratoire (voir la figure 1A-i).
   3. Coupez l’embout d’une pipette de 1 000 μL (sans filtre) et utilisez-le pour pipeter une petite goutte de gélose sur la glissière centrale (Figure 1A-i).
   4. Aplatir la gélose en appuyant sur une autre glissière sur la gélose (Figure 1A-ii).
   5. Après refroidissement, couper la gélose en un petit disque à l’aide de l’ouverture d’un tube de culture en verre de 13 mm x 100 mm (figure 1A-iii), puis retirer la gélose environnante.
2. Préparation de la solution de laminage de la vis sans fin
   1. Dissoudre la poudre de muscimol dans M9 pour créer un stock de 30 mM. Séparer en aliquotes de 50 μL et conserver à 4 °C.
   2. Décongeler une nouvelle partie aliquote de 30 mM de muscimol tous les 3 à 5 jours (et conserver à 20 °C pendant l’utilisation).
   3. Diluer un stock de muscimol de 30 mM dans un rapport de 1:1 avec des billes de polystyrène pour obtenir la solution de laminage.
3. Positionnement d’un ver pour l’imagerie
   1. Placer 1,6 μL de la solution à rouler au centre du tampon de gélose
      REMARQUE : La quantité de liquide doit être ajustée pour l’imagerie des animaux plus jeunes (moins) ou plus âgés (plus).
   2. À l’aide du pic de vermifuge préféré (c.-à-d. un pic en verre ou en platine)¹³, transvaser un ver de l’âge désiré sans le phénotype multivulvaire¹¹ dans la solution à rouler sur le tampon de gélose (figure 1A-iv).
      NOTE. Les données représentatives proviennent d’hermaphrodites âgés de 1 jour (souche GCaMP6f = FJH185; souche mitoGCaMP; FJH597; voir le tableau supplémentaire 1), qui peut être identifié par la présence d’une seule rangée d’œufs. Voir la discussion pour plus de détails sur le travail avec des vers d’âges différents.
   3. Attendez ~5 minutes que le muscimol réduise le mouvement du ver, puis déposez une glissière de 22 mm x 22 mm sur le dessus du tampon de gélose limitant physiquement le mouvement du ver.
   4. Pour l’imagerie des neurites dans le cordon nerveux ventral, rouler le ver dans l’orientation indiquée à la figure 1B,C en faisant glisser légèrement la lamelle de couverture.
      NOTE. Pour visualiser le cordon nerveux ventral, positionnez le ver avec la tête vers le haut et roulez le ver jusqu’à ce que l’intestin soit du côté droit de la partie proximale et de la partie gauche de la partie distale du ver (du point de vue du spectateur). Inverser cette orientation (Figure 1C) pour l’imagerie des neurites dans le cordon nerveux dorsal.
4. Montage du ver sur un microscope
   1. Placez une goutte d’huile d’immersion sur la lamelle de couverture avant de la monter sur la platine du microscope.
   2. Recherchez le ver à l’aide d’un objectif à faible grossissement (10x) en fond clair.
   3. Passez à l’objectif 100x et ajustez la mise au point.
   4. Localisez le neurite AVA à l’aide de l’éclairage de la GCaMP ou de la mitoGCaMP avec le laser d’imagerie de 488 nm.
      REMARQUE : Utilisez de petits ajustements pour éviter d’écraser le ver ou de retirer la lamelle de couverture.

4. Acquisition de flux d’images haute résolution

1. In vivo Imagerie GCaMP
   1. Réglez le temps d’exposition sur 20 ms.
   2. Ajustez les paramètres du laser d’imagerie et d’acquisition jusqu’à ce que la fluorescence GCaMP basale se situe dans la plage médiane de la plage dynamique de la caméra¹⁴. Reportez-vous à la discussion pour obtenir des suggestions sur l’optimisation des paramètres d’imagerie à l’aide d’autres configurations de microscopie.
      NOTE. Pour la configuration optique utilisée dans cette étude, réglez le laser d’imagerie 488 nm sur les paramètres de sortie suivants : puissance laser = 50 % et atténuation = 1. Modifiez les paramètres d’acquisition supplémentaires comme suit : gain EM = 200 et gain préamplificateur = 1.
   3. Une fois que la neurite AVA est localisée à l’aide de la fluorescence GCaMP à un grossissement de 100x, réglez le ZDC (voir le tableau des matériaux) sur une plage de ±30 μm et lancez la mise au point automatique continue. Corrigez manuellement le plan focal si nécessaire avant l’imagerie.
   4. Acquérir un flux d’images à un grossissement de 100x. Des durées allant jusqu’à 10 min peuvent être atteintes avec la configuration utilisée dans cette étude.
2. Imagerie mitoGCaMP in vivo
   1. Suivez les étapes 4.1.1 à 4.1.2 au besoin pour acquérir la fluorescence mitoGCaMP basale dans le milieu de gamme pour la plage dynamique¹⁴ de la caméra.
      NOTE. Pour la configuration optique utilisée dans cette étude, réglez le laser d’imagerie 488 nm sur les paramètres de sortie suivants : puissance laser = 20 % et atténuation = 10. Modifiez les paramètres d’acquisition comme suit : gain EM = 100 et gain préamplificateur = 2.
   2. Une fois que les mitochondries dans le neurite AVA sont localisées à l’aide de la fluorescence mitoGCaMP, définissez le ZDC comme décrit ci-dessus à l’étape 3.3.
   3. Acquérir un flux d’images à un grossissement de 100x.

5. Analyse du flux d’images

1. Ouvrez le flux d’images dans un logiciel d’imagerie approprié pour analyser les valeurs de pixels dans une série d’images (voir Tableau des matériaux).
2. À l’aide de l’outil Sélection de polygones , définissez la région d’intérêt subcellulaire (ROI) contenant GCaMP ou mitoGCaMP.
3. Cliquez sur Analyser > Outils > Gestionnaire de retour sur investissement. Dans le Gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur Ajouter , puis sur Plus > Multimesure. Dans la fenêtre Multimesure, cliquez sur OK pour collecter automatiquement les intensités de pixels moyenne, minimale et maximale du retour sur investissement défini ci-dessus pour chaque image du flux d’images en vue d’une analyse plus approfondie.
   NOTE. Il est recommandé de normaliser l’intensité moyenne des pixels (moyenne F) à l’intensité minimale (F min) pour chaque retour sur investissement en utilisant le rapport F_{moyenne / F min} pour tenir compte des différences de fluorescence dues au positionnement dans le plan z. Jetez les flux d’image avec le mouvement du ver pendant l’imagerie, car cela affecterait également les mesures de fluorescence.

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Résultats

Ces deux protocoles permettent l’acquisition rapide de niveaux différentiels de Ca²⁺ dans les régions subcellulaires et les organites des neurites individuels in vivo avec une résolution spatiale élevée. Le premier protocole permet la mesure du Ca²⁺ cytoplasmique avec une résolution temporelle et spatiale élevée. Ceci est démontré ici en utilisant l’expression spécifique à la cellule de GCaMP6f dans les interneurones de commande AVA glutamatergiques¹⁵...

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Discussion

La première considération lors de la mise en œuvre de la méthode décrite implique la sélection d’un indicateur Ca²⁺ avec des caractéristiques idéales pour la question de recherche donnée. Les indicateurs cytoplasmiques Ca 2+ ont généralement une forte affinité pour Ca 2+, et la sensibilité de ces indicateurs au Ca²⁺ est inversement liée à la cinétique (taux marche/arrêt)^16,17. Cela signifie que la sen...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x/1.40 Oil objective	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objective	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
Beam homogenizer	Andor Technologies		Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table	TMC		With vibration control
Disposable culture tubes	VWR	47729-572	13 mm x 100 mm
Environmental chamber	Thermo Scientific	3940	Set to 20 °C
Filter wheel or slider	ASI		For 25 mm diameter filters
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Worm strain
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Worm strain
GFP bandpass emission filter	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner	Andor Technologies		4 laser lines
ILE solid state 488 nm laser	Andor Technologies		50 mW
ImageJ	National Institutes of Health		Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope	Olympus		With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera	Andor Technologies
Low auto-fluorescence immersion oil	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Version 7.10.1
Microscope control box	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
pAS1	AddGene	194970	Plasmid
pBSKS	Stratagene
pCT61			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1	AddGene	194969	Plasmid
Polybead microspheres	Polysciences Inc.	00876-15	0.094 µm
Stability chamber	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Set to 15 °C
Stage controller	ASI		With filter wheel control
Standard microscope slide	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller	Olympus		I3-TPC
Z-drift corrector	Olympus		IX3-ZDC2