Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Resumen

Los métodos actuales describen un enfoque no ratiométrico para imágenes de calcio subcompartimentales de alta resolución in vivo en Caenorhabditis elegans utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente fácilmente disponibles.

Resumen

Las imágenes de calcio (Ca 2+) se han utilizado en gran medida para examinar la actividad neuronal, pero cada vez está más claro que el manejo subcelular de Ca²⁺ es un componente crucial de la señalización intracelular. La visualización de la dinámica subcelular de Ca²⁺ in vivo, donde las neuronas pueden estudiarse en sus circuitos nativos e intactos, ha demostrado ser técnicamente desafiante en sistemas nerviosos complejos. La transparencia y el sistema nervioso relativamente simple del nematodo Caenorhabditis elegans permiten la expresión específica de la célula y la visualización in vivo de etiquetas e indicadores fluorescentes. Entre estos se encuentran indicadores fluorescentes que han sido modificados para su uso en el citoplasma, así como varios compartimentos subcelulares, como las mitocondrias. Este protocolo permite obtener imágenes no ratiométricas de Ca 2+ in vivo con una resolución subcelular que permite el análisis de la dinámica de Ca²⁺ hasta el nivel de las espinas dendríticas individuales y las mitocondrias. Aquí, se utilizan dos indicadores codificados genéticamente disponibles con diferentes afinidades de Ca 2+ para demostrar el uso de este protocolo para medir los niveles relativos de Ca²⁺ dentro del citoplasma o la matriz mitocondrial en un solo par de interneuronas excitatorias (AVA). Junto con las manipulaciones genéticas y las observaciones longitudinales posibles en C. elegans, este protocolo de imagen puede ser útil para responder preguntas sobre cómo el manejo de Ca²⁺ regula la función neuronal y la plasticidad.

Introducción

Los iones de calcio (^Ca2+) son portadores altamente versátiles de información en muchos tipos de células. En las neuronas, el Ca²⁺ es responsable de la liberación dependiente de la actividad de los neurotransmisores, la regulación de la motilidad del citoesqueleto, el ajuste fino de los procesos metabólicos, así como muchos otros mecanismos necesarios para el mantenimiento y la función neuronal adecuados ^1,2. Para garantizar una señalización intracelular efectiva, las neuronas deben mantener bajos los niveles basales de Ca²⁺ en su citoplasma³. Esto se logra mediante mecanismos cooperativos de manejo de Ca 2+, incluida la absorción de Ca²⁺ en orgánulos como el retículo endoplásmico (RE) y las mitocondrias. Estos procesos, además de la disposición de los canales iónicos permeables al Ca 2+ en la membrana plasmática, dan como resultado niveles heterogéneos de Ca²⁺ citoplasmático en toda la neurona.

La heterogeneidad de Ca 2+ durante el reposo y la activación neuronal permite la regulación diversa y específica de la ubicación de los mecanismos dependientes de Ca ²⁺ 1. Un ejemplo de los efectos específicos de la concentración de Ca 2+ es la liberación de Ca²⁺ del RE a través de los receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (InsP 3). Se requieren niveles bajos de Ca²⁺ en combinación con InsP₃ para la apertura del poro permeable al calcio del receptor. Alternativamente, los niveles altos de Ca²⁺ inhiben directa e indirectamente el receptor⁴. La importancia de la homeostasis del Ca 2+ para la función neuronal adecuada está respaldada por la evidencia que sugiere que la manipulación y señalización intracelular del Ca²⁺ interrumpido es un paso temprano en la patogénesis de los trastornos neurodegenerativos y el envejecimiento natural ^5,6. Específicamente, la absorción y liberación anormal de Ca²⁺ por el RE y las mitocondrias están relacionadas con la aparición de disfunción neuronal en la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington ^6,7.

El estudio de la dishomeostasis de Ca 2+ durante el envejecimiento natural o la neurodegeneración requiere la observación longitudinal de los niveles de Ca²⁺ con resolución subcelular en un organismo vivo e intacto en el que se mantiene la arquitectura celular nativa (es decir, la disposición de las sinapsis y la distribución de los canales iónicos). Con este fin, este protocolo proporciona orientación sobre el uso de dos sensores de Ca 2+ codificados genéticamente fácilmente disponibles para registrar la dinámica de Ca²⁺ in vivo con alta resolución espacial y temporal. Los resultados representativos adquiridos utilizando el método descrito en C. elegans demuestran cómo la expresión de indicadores de Ca 2+ en el citoplasma o matriz mitocondrial de neuronas individuales puede permitir la adquisición rápida de imágenes fluorescentes (hasta 50 Hz) que ilustran la dinámica de Ca 2+ con la capacidad adicional de discernir los niveles de Ca ²⁺ dentro de estructuras individuales similares a espinas y mitocondrias individuales.

Protocolo

1. Creación de cepas transgénicas

1. Utilizando un método de clonación de la elección^8,9, clonar vectores de expresión para contener el promotor Pflp-18 o Prig-3 (para señal específica de AVA en el cordón nervioso ventral), seguido del indicador de elección Ca²⁺, y luego un UTR 3' (ver la discusión para más información)¹⁰. Una lista de plásmidos y sus fuentes se puede encontrar en la Tabla Suplementaria 1.
2. Seguir el protocolo establecido para la creación de cepas transgénicas mediante la microinyección de una mezcla de ADN (<100 ng/μL; ver Tabla Suplementaria 1 para las concentraciones de cada plásmido) que contiene el transgén indicador Ca²+ (~20 ng/μL) y el ADN de rescate lin-15⁺ (marcador de selección) en la gónada de un adulto de 1 día de edad C. elegans¹⁰ (genotipo: LIN-15 (N765TS); Fenotipo: Multivulva)^10,11.
   NOTA. Mantener los padres lin-15(n765ts) a 15 °C para suprimir la mutación sensible a la temperatura.
3. Mantener los padres inyectados a 20 °C hasta que la progenie F1 alcance la edad adulta para permitir la selección transgénica utilizando la ausencia del fenotipo multivulva.
4. Clonalmente pasaje¹³ adultos F1 progenie que no tienen el fenotipo multivulva ya que esto indica la expresión de la matriz extracromosómica que contiene el indicador Ca^{2+ 11}.
5. Evaluar la expresión del indicador Ca²⁺ en la progenie F2 o F3 que no tienen el fenotipo multivulva mediante el montaje y la obtención de imágenes de adultos de 1 día de edad, como se describe más adelante en la sección 3.
   NOTA. Se requiere una expresión relativamente alta del indicador para la adquisición rápida de imágenes como se describe aquí (ver la discusión para más detalles).
6. Realizar experimentos en generaciones posteriores de las cepas transgénicas con una expresión óptima del indicador Ca 2+ (ver la discusión para más detalles), manteniendo las cepas en condiciones estándar (²⁰ °C en placas NGM)¹².

2. Configuración óptica

1. Use un microscopio capaz de obtener imágenes de lapso de tiempo a largo plazo.
   NOTA. Los datos representativos se adquirieron utilizando un microscopio confocal de disco giratorio invertido equipado con láseres de excitación de 488 nm y 561 nm.
2. Utilice un objetivo de bajo aumento (es decir, 10x/0,40) para la localización cruda del gusano.
3. Para lograr la resolución subcelular, cambie y localice las neuronas utilizando un objetivo de gran aumento.
   NOTA. Se utilizó un objetivo de aceite 100x/1.40 NA para adquirir los datos representativos en este estudio.
4. Adquiera las imágenes utilizando una cámara ultrasensible capaz de adquirir imágenes rápidamente (>50 fps).
5. Utilice un filtro de emisión estándar para el indicador de Ca²⁺ de elección (es decir, un filtro de emisión de 525 nm ± 50 nm para GCaMP6f y mitoGCaMP).
6. Agregue un corrector de deriva Z (ZDC) para la adquisición de flujos de imágenes de más de 10 s, ya que la desecación de la almohadilla de agar durante la sesión de imágenes hace que la neurita se desenfoque en varios segundos.
   NOTA. Si una configuración de microscopía no permite ZDC, o si se desean períodos de imagen largos (>20 minutos), aplique un borde de grasa de silicona o vaselina derretida alrededor de la almohadilla de agar para disminuir la desecación.

3. Preparación de gusanos para imágenes

1. Preparación de las almohadillas de agar
   1. Hacer 3 ml de agar al 10% disolviendo agar de grado molecular en M9¹² en un tubo de cultivo de vidrio de 13 mm x 100 mm y calentar en el microondas durante varios segundos (ver Tabla de materiales).
      NOTA. El agar fundido se puede mantener en un bloque de calor hasta 1 h o se puede hacer fresco cada vez que se necesitan almohadillas de agar.
   2. Coloque un portaobjetos de microscopio entre dos portaobjetos adicionales que tengan dos capas de cinta de laboratorio (véase la figura 1A-i).
   3. Corte la punta de una punta de pipeta de 1.000 μL (sin filtro) y utilícela para pipetear una pequeña gota de agar sobre el cubreobjetos central (Figura 1A-i).
   4. Aplanar el agar presionando otro deslizamiento hacia abajo en la parte superior del agar (Figura 1A-ii).
   5. Después del enfriamiento, corte el agar en un disco pequeño usando la abertura de un tubo de cultivo de vidrio de 13 mm x 100 mm (Figura 1A-iii), y luego retire el agar circundante.
2. Preparación de la solución de laminación de gusanos
   1. Disuelva el polvo de muscimol en M9 para crear un stock de 30 mM. Separar en alícuotas de 50 μL y conservar a 4 °C.
   2. Descongelar una nueva alícuota de muscimol de 30 mM cada 3-5 días (y conservar a 20 °C durante el uso).
   3. Diluir una culata de muscimol de 30 mM en una proporción de 1:1 con perlas de poliestireno para hacer la solución de laminación.
3. Posicionamiento de un gusano para obtener imágenes
   1. Coloque 1,6 μL de la solución laminada en el centro de la almohadilla de agar.
      NOTA: La cantidad de líquido debe ajustarse para obtener imágenes de animales más jóvenes (menos) o más viejos (más).
   2. Usando el tornillo sin fin preferido (es decir, un pico de alambre de vidrio o platino)¹³, transfiera un gusano de la edad deseada sin el fenotipo¹¹ de la vulva múltiple a la solución de laminación en la almohadilla de agar (Figura 1A-iv).
      NOTA. Los datos representativos son de hermafroditas de 1 día de edad (cepa GCaMP6f = FJH185; cepa mitoGCaMP; FJH597; véase la Tabla suplementaria 1), que puede identificarse por la presencia de una sola fila de huevos. Consulte la discusión para obtener más detalles sobre cómo trabajar con gusanos de diferentes edades.
   3. Espere ~ 5 minutos para que el muscimol reduzca el movimiento del gusano, y luego deje caer un cubreobjetos de 22 mm x 22 mm sobre la almohadilla de agar, restringiendo físicamente el movimiento del gusano.
   4. Para obtener imágenes de neuritas en el cordón nervioso ventral, haga rodar el gusano en la orientación que se muestra en la Figura 1B,C deslizando ligeramente el cubreobjetos.
      NOTA. Para visualizar el cordón nervioso ventral, coloque el gusano con la cabeza hacia arriba y haga rodar el gusano hasta que el intestino esté en el lado derecho de la porción proximal y a la izquierda para la porción distal del gusano (desde la perspectiva del espectador). Invierta esta orientación (Figura 1C) para obtener imágenes de neuritas en el cordón nervioso dorsal.
4. Montaje del gusano en un microscopio
   1. Coloque una gota de aceite de inmersión en el cubreobjetos antes de montarlo en la plataforma del microscopio.
   2. Encuentre el gusano utilizando un objetivo de bajo aumento (10x) en campo claro.
   3. Cambia al objetivo 100x y ajusta el enfoque.
   4. Localice la neurita AVA utilizando la iluminación del GCaMP o mitoGCaMP con el láser de imágenes de 488 nm.
      NOTA: Utilice pequeños ajustes para evitar aplastar el gusano o arrancar el cubreobjetos.

4. Adquisición de flujos de imágenes de alta resolución

1. In vivo Imágenes GCaMP
   1. Ajuste el tiempo de exposición a 20 ms.
   2. Ajuste el láser de imágenes y los ajustes de adquisición hasta que la fluorescencia GCaMP basal esté en el rango medio del rango dinámico¹⁴ de la cámara. Consulte la discusión para obtener sugerencias sobre cómo optimizar los parámetros de imagen utilizando otras configuraciones de microscopía.
      NOTA. Para la configuración óptica utilizada en este estudio, ajuste el láser de imágenes de 488 nm en los siguientes ajustes de salida: potencia del láser = 50% y atenuación = 1. Modifique los ajustes de adquisición adicionales de la siguiente manera: ganancia EM = 200 y ganancia del preamplificador = 1.
   3. Después de localizar la neurita AVA utilizando la fluorescencia GCaMP con un aumento de 100x, ajuste el ZDC (consulte la Tabla de materiales) a un rango de ±30 μm e inicie el enfoque automático continuo. Corrija manualmente el plano focal según sea necesario antes de obtener imágenes.
   4. Adquiera un flujo de imágenes con un aumento de 100x. Se pueden lograr duraciones de hasta 10 minutos con la configuración utilizada en este estudio.
2. Imágenes mitoGCaMP in vivo
   1. Siga los pasos 4.1.1-4.1.2 según sea necesario para adquirir la fluorescencia mitoGCaMP basal en el rango medio para el rango dinámico¹⁴ de la cámara.
      NOTA. Para la configuración óptica utilizada en este estudio, ajuste el láser de imágenes de 488 nm a los siguientes ajustes de salida: potencia del láser = 20% y atenuación = 10. Modifique la configuración de adquisición a lo siguiente: ganancia EM = 100 y ganancia del preamplificador = 2.
   2. Después de localizar las mitocondrias en la neurita AVA utilizando la fluorescencia mitoGCaMP, configure el ZDC como se describe anteriormente en el paso 3.3.
   3. Adquiera un flujo de imágenes con un aumento de 100x.

5. Análisis del flujo de imágenes

1. Abra la secuencia de imágenes en un software de imagen adecuado para analizar los valores de píxeles en una serie de imágenes (consulte Tabla de materiales).
2. Con la herramienta Selección de polígonos, defina la región de interés subcelular (ROI) que contiene GCaMP o mitoGCaMP.
3. Haga clic en Analizar herramientas > > ROI Manager. En el Administrador de ROI, haga clic en Agregar y, a continuación, en Más > Multimedida. En la ventana Multimedida, haga clic en Aceptar para recopilar automáticamente las intensidades de píxeles promedio, mínimo y máximo del ROI definido anteriormente para cada fotograma de la secuencia de imágenes para su posterior análisis.
   NOTA. Se recomienda que la intensidad media de píxeles (F_promedio) se normalice a la intensidad mínima (F min) para cada ROI utilizando la relación F_avg/F_min para tener en cuenta las diferencias de fluorescencia debidas al posicionamiento en el plano z. Descarte los flujos de imágenes con el movimiento del gusano durante la obtención de imágenes, ya que esto también afectaría las mediciones de fluorescencia.

Resultados

Estos dos protocolos permiten la adquisición rápida de niveles diferenciales de Ca²⁺ dentro de las regiones subcelulares y orgánulos de neuritas individuales in vivo con alta resolución espacial. El primer protocolo permite la medición de Ca²⁺ citoplasmático con alta resolución temporal y espacial. Esto se demuestra aquí utilizando la expresión celular específica de GCaMP6f en las interneuronas¹⁵ del comando AVA glutamatérgico, cuyas neuritas recorren toda...

Discusión

La primera consideración al implementar el método descrito implica la selección de un indicador Ca²⁺ con características ideales para la pregunta de investigación dada. Los indicadores citoplasmáticos de Ca 2+ suelen tener una alta afinidad por el Ca 2+, y la sensibilidad de estos indicadores al Ca²⁺ está inversamente relacionada con la cinética (tasa de encendido/apagado)^16,17. Esto significa que la sensibilida...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x/1.40 Oil objective	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objective	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
Beam homogenizer	Andor Technologies		Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table	TMC		With vibration control
Disposable culture tubes	VWR	47729-572	13 mm x 100 mm
Environmental chamber	Thermo Scientific	3940	Set to 20 °C
Filter wheel or slider	ASI		For 25 mm diameter filters
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Worm strain
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Worm strain
GFP bandpass emission filter	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner	Andor Technologies		4 laser lines
ILE solid state 488 nm laser	Andor Technologies		50 mW
ImageJ	National Institutes of Health		Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope	Olympus		With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera	Andor Technologies
Low auto-fluorescence immersion oil	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Version 7.10.1
Microscope control box	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
pAS1	AddGene	194970	Plasmid
pBSKS	Stratagene
pCT61			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1	AddGene	194969	Plasmid
Polybead microspheres	Polysciences Inc.	00876-15	0.094 µm
Stability chamber	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Set to 15 °C
Stage controller	ASI		With filter wheel control
Standard microscope slide	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller	Olympus		I3-TPC
Z-drift corrector	Olympus		IX3-ZDC2