הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

Summary

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

Abstract

הדמיית סידן (Ca 2+) שימשה בעיקר לבחינת הפעילות העצבית, אך מתברר יותר ויותר כי טיפול תת-תאי ב- Ca²⁺ הוא מרכיב חיוני באיתות תוך תאי. ההדמיה של דינמיקת Ca²⁺ in vivo תת-תאית, שבה ניתן לחקור נוירונים במעגלים הטבעיים והשלמים שלהם, הוכחה כמאתגרת מבחינה טכנית במערכות עצבים מורכבות. השקיפות ומערכת העצבים הפשוטה יחסית של הנמטודה Caenorhabditis elegans מאפשרות ביטוי ספציפי לתא והדמיה in vivo של תגים ואינדיקטורים פלואורסצנטיים. בין אלה הם אינדיקטורים פלואורסצנטיים שהותאמו לשימוש בציטופלסמה, כמו גם תאים תת-תאיים שונים, כגון המיטוכונדריה. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה לא רציומטרית של Ca 2+ in vivo עם רזולוציה תת-תאית המאפשרת ניתוח של דינמיקת Ca²⁺ עד לרמת עמוד השדרה הדנדריטי והמיטוכונדריה הבודדים. כאן, שני אינדיקטורים מקודדים גנטית זמינים עם זיקות Ca 2+ שונות משמשים כדי להדגים את השימוש בפרוטוקול זה למדידת רמות Ca²⁺ יחסיות בתוך הציטופלסמה או המטריצה המיטוכונדריאלית בזוג יחיד של נוירונים מעוררים (AVA). יחד עם המניפולציות הגנטיות ותצפיות האורך האפשריות ב- C. elegans, פרוטוקול הדמיה זה עשוי להיות שימושי לענות על שאלות לגבי האופן שבו טיפול Ca²⁺ מווסת את התפקוד העצבי ואת הפלסטיות.

Introduction

יוני סידן (Ca²⁺) הם נשאים רב-תכליתיים ביותר של מידע בסוגי תאים רבים. בנוירונים, Ca²⁺ אחראי על שחרור תלוי פעילות של מוליכים עצביים, ויסות תנועתיות השלד הציטו-שלד, כוונון עדין של תהליכים מטבוליים, כמו גם מנגנונים רבים אחרים הדרושים לתחזוקה עצבית נאותה ותפקוד ^1,2. כדי להבטיח איתות תוך-תאי יעיל, תאי עצב חייבים לשמור על רמות נמוכות של Ca²⁺ בסיסי בציטופלסמה³ שלהם. זה מושג על ידי מנגנוני טיפול Ca 2+ שיתופיים, כולל ספיגה של Ca²⁺ לתוך אברונים כגון הרשתית האנדופלסמית (ER) והמיטוכונדריה. תהליכים אלה, בנוסף לסידור של תעלות יונים חדירות Ca 2+ בקרום הפלזמה, גורמים לרמות הטרוגניות של Ca²⁺ ציטופלזמי בכל תא העצב.

הטרוגניות Ca 2+ במהלך מנוחה והפעלה עצבית מאפשרת ויסות מגוון וספציפי למיקום של מנגנונים תלויי Ca^{2+ 1}. דוגמה אחת להשפעות הספציפיות לריכוז של Ca 2+ היא שחרור Ca²⁺ מהמיון דרך קולטני אינוסיטול 1,4,5-trisphosphate (InsP₃). רמות נמוכות של Ca²⁺ בשילוב עם InsP₃ נדרשות לפתיחת נקבובית הסידן החדירה של הקולטן. לחלופין, רמות גבוהות של Ca²⁺ מעכבות באופן ישיר ועקיף את הקולטן⁴. החשיבות של Ca 2+ הומאוסטזיס לתפקוד עצבי תקין נתמכת על ידי ראיות המצביעות על כך שטיפול ואיתות תוך תאי Ca²⁺ משובש הוא צעד מוקדם בפתוגנזה של הפרעות נוירודגנרטיביות והזדקנות טבעית ^5,6. באופן ספציפי, ספיגה חריגה של Ca²⁺ ושחרור על ידי המיון והמיטוכונדריה קשורים להופעת תפקוד עצבי לקוי במחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון ומחלת הנטינגטון ^6,7.

המחקר של Ca 2+ dyshomeostasis במהלך הזדקנות טבעית או ניוון עצבי דורש תצפית אורכית של רמות Ca²⁺ עם רזולוציה תת-תאית באורגניזם חי ושלם שבו נשמרת הארכיטקטורה התאית הטבעית (כלומר, סידור הסינפסות ופיזור תעלות היונים). לשם כך, פרוטוקול זה מספק הנחיות לשימוש בשני חיישני Ca 2+ זמינים ומקודדים גנטית להקלטת דינמיקת Ca²⁺ in vivo ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה. התוצאות המייצגות שהתקבלו בשיטה המתוארת ב- C. elegans מדגימות כיצד ביטוי של אינדיקטורים Ca 2+ בציטופלסמה או במטריצה המיטוכונדריאלית של נוירונים בודדים יכול לאפשר רכישה מהירה של תמונות פלואורסצנטיות (עד 50 הרץ) הממחישות את הדינמיקה של Ca 2+ עם יכולת נוספת להבחין ברמות Ca ²⁺ בתוך מבנים דמויי עמוד שדרה יחיד ומיטוכונדריה בודדת.

Protocol

1. יצירת זנים טרנסגניים

1. באמצעות שיטת שיבוט של בחירה^8,9, וקטורי ביטוי שיבוט כדי להכיל את מקדם Pflp-18 או Prig-3 (עבור אות ספציפי AVA בחוט העצב הגחוני), ואחריו מחוון Ca²⁺ של בחירה^, ולאחר מכן 3' UTR (ראה דיון למידע נוסף)¹⁰. רשימה של פלסמידים ומקורותיהם ניתן למצוא בטבלה משלימה 1.
2. עקוב אחר הפרוטוקול שנקבע ליצירת זנים טרנסגניים באמצעות מיקרו-הזרקה של תערובת DNA (<100 ng/μL; ראה טבלה משלימה 1 לריכוזים של כל פלסמיד) המכילה את טרנסגן האינדיקטור Ca 2+ (~²⁰ ng/μL) ואת DNA ההצלה lin-15⁺ (סמן בחירה) לגונד של בוגר בן יום אחד C. elegans¹⁰ (גנוטיפ: לין-15(N765TS); פנוטיפ: רב פות)^10,11.
   הערה. שמור על הורים lin-15(n765ts) ב 15 ° C כדי לדכא מוטציה רגישה לטמפרטורה.
3. שמרו על ההורים המוזרקים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד שצאצאי F1 יגיעו לבגרות כדי לאפשר ברירה מהונדסת תוך היעדר פנוטיפ רב פות.
4. מעבר קלונלי¹³ צאצאי F1 בוגרים שאין להם את הפנוטיפ הרב-פותי מכיוון שהדבר מציין את הביטוי של המערך החוץ-כרומוזומלי המכיל את מחוון Ca^{2+ 11}.
5. הערך את הביטוי של מחוון Ca²⁺ בצאצאי F2 או F3 שאין להם את הפנוטיפ הרב-פות על ידי הרכבה והדמיה של מבוגרים בני יום אחד כמתואר בהמשך סעיף 3.
   הערה. נדרש ביטוי גבוה יחסית של המחוון לרכישה מהירה של תמונות כמתואר כאן (ראו בהרחבה בדיון).
6. לבצע ניסויים בדורות הבאים של הזנים הטרנסגניים עם ביטוי אופטימלי של מחוון Ca 2+ (ראה דיון לפרטים נוספים), שמירה על הזנים בתנאים סטנדרטיים (²⁰ ° C על לוחות NGM)¹².

2. הגדרה אופטית

1. השתמש במיקרוסקופ המסוגל לבצע הדמיה בהילוך מהיר לטווח ארוך.
   הערה. הנתונים המייצגים נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב הפוך המצויד בלייזר עירור 488 ננומטר ו 561 ננומטר.
2. השתמש ביעד הגדלה נמוכה (כלומר, 10x/0.40) עבור לוקליזציה גסה של התולעת.
3. כדי להשיג רזולוציה תת-תאית, עברו לתאי העצב ומקמו אותם באמצעות מטרת הגדלה גבוהה.
   הערה. מטרת שמן 100x/1.40 NA שימשה להשגת הנתונים המייצגים במחקר זה.
4. השג את התמונות באמצעות מצלמה רגישה במיוחד המסוגלת לקלוט תמונה במהירות (>50 fps).
5. השתמש במסנן פליטה סטנדרטי עבור מחוון Ca²⁺ לפי בחירתו (כלומר, מסנן פליטה של 525 ננומטר ± 50 ננומטר עבור GCaMP6f ו- mitoGCaMP).
6. הוסף מתקן Z-drift (ZDC) לרכישת זרמי תמונה ארוכים מ- 10 שניות, מכיוון שהתייבשות כרית האגר במהלך סשן ההדמיה גורמת לנוריט לצאת מהמיקוד תוך מספר שניות.
   הערה. אם הגדרת מיקרוסקופ אינה מאפשרת ZDC, או אם יש צורך בפרקי הדמיה ארוכים (>20 דקות), יש למרוח גבול של שומן סיליקון או ג'ל פטרולאום מומס סביב כרית האגר כדי להאט את הייבוש.

3. הכנת תולעים להדמיה

1. הכנת רפידות האגר
   1. הכינו 3 מ"ל של 10% אגר על ידי המסת אגר כיתה מולקולרית ב-M9¹² בשפופרת תרבית זכוכית בגודל 13 מ"מ x 100 מ"מ וגלי מיקרו למשך מספר שניות (ראו טבלת חומרים).
      הערה. אגר מותך יכול להישמר על בלוק חום עד שעה או יכול להיות טרי בכל פעם שיש צורך ברפידות אגר.
   2. מקמו שקופית מיקרוסקופ בין שתי שקופיות נוספות שבכל אחת מהן יש שתי שכבות של סרט מעבדה (ראו איור 1A-i).
   3. חתכו קצה של קצה פיפטה בנפח 1,000 מיקרוליטר (ללא מסנן), והשתמשו בו כדי לקלוט טיפה קטנה של אגר על הכיסוי המרכזי (איור 1A-i).
   4. שטחו את האגר על-ידי לחיצה על שקופית נוספת כלפי מטה על גבי האגר (איור 1A-ii).
   5. לאחר הקירור, חתכו את האגר לדיסקית קטנה באמצעות פתח של צינור תרבית זכוכית בגודל 13 מ"מ x 100 מ"מ (איור 1A-iii), ולאחר מכן הסירו את האגר שמסביב.
2. הכנת תמיסת גלגול התולעים
   1. יש להמיס אבקת מוסצימול ב-M9 ליצירת ציר של 30 מילימול. יש להפריד לתוך 50 μL aliquots, ולאחסן ב 4 ° C.
   2. הפשיר aliquot חדש של 30 mM muscimol כל 3-5 ימים (ולאחסן ב 20 ° C בזמן השימוש).
   3. לדלל ציר muscimol 30 mM ביחס של 1:1 עם חרוזי פוליסטירן כדי ליצור את הפתרון מתגלגל.
3. מיקום תולעת לצורך הדמיה
   1. מניחים 1.6 μL של תמיסת הגלגול במרכז כרית האגר.
      הערה: יש להתאים את כמות הנוזלים להדמיה של בעלי חיים צעירים יותר (פחות) או מבוגרים יותר (יותר).
   2. באמצעות פיק התולעת המועדף (כלומר, פיק חוטי זכוכית או פלטינה)¹³, העבירו תולעת בגיל הרצוי ללא פנוטיפ רב-פות¹¹ לתמיסה המתגלגלת על כרית האגר (איור 1A-iv).
      הערה. הנתונים המייצגים הם מהרמפרודיטים בני יום אחד (זן GCaMP6f = FJH185; זן mitoGCaMP; FJH597; ראו טבלה משלימה 1), שניתן לזהותה על ידי הימצאות שורה אחת בלבד של ביצים. ראה את הדיון לפרטים נוספים על עבודה עם תולעים בגילאים שונים.
   3. המתן ~ 5 דקות עד שהמוסצימול יפחית את תנועת התולעת, ולאחר מכן שחרר כיסוי בגודל 22 מ"מ x 22 מ"מ על גבי כרית האגר, המגביל פיזית את תנועת התולעת.
   4. לצורך הדמיה של תאי עצב בחוט העצב הגחוני, גלגלו את התולעת לכיוון שמוצג באיור 1B,C על-ידי החלקה קלה של הכיסוי.
      הערה. כדי לדמיין את חוט העצב הגחוני, מקם את התולעת עם הראש כלפי מעלה, וגלגל את התולעת עד שהמעי נמצא בצד ימין של החלק הפרוקסימלי ובצד שמאל של החלק הדיסטלי של התולעת (מנקודת מבטו של הצופה). הפוך את הכיוון הזה (איור 1C) עבור תאי עצב לדימות בחוט העצב הגבי.
4. הרכבת התולעת על מיקרוסקופ
   1. הניחו טיפת שמן טבילה על הכיסוי לפני הרכבתו על במת המיקרוסקופ.
   2. מצא את התולעת באמצעות יעד הגדלה נמוכה (פי 10) ב- brightfield.
   3. עבור למטרה של 100x וכוונן את המיקוד.
   4. אתר את נוירוט AVA באמצעות הארה של GCaMP או mitoGCaMP עם לייזר הדמיה 488 ננומטר.
      הערה: השתמש בהתאמות קטנות כדי למנוע מעיכת התולעת או משיכת הכיסוי.

4. רכישת זרמי תמונה ברזולוציה גבוהה

1. In vivo הדמיית GCaMP
   1. הגדר את זמן החשיפה ל- 20 אלפיות השנייה.
   2. כוונן את הגדרות ההדמיה והרכישה של לייזר עד שהפלואורסצנטיות הבסיסית של GCaMP תגיע למרכז הטווח הדינמי של המצלמה¹⁴. עיין בדיון לקבלת הצעות לאופטימיזציה של פרמטרי ההדמיה באמצעות הגדרות מיקרוסקופיה אחרות.
      הערה. עבור ההגדרה האופטית המשמשת במחקר זה, הגדר את לייזר ההדמיה 488 ננומטר להגדרות הפלט הבאות: עוצמת לייזר = 50% והנחתה = 1. שנה את הגדרות הרכישה הנוספות באופן הבא: רווח EM = 200 ורווח טרום מגבר = 1.
   3. לאחר איתור הנוירוט AVA באמצעות פלואורסצנטיות GCaMP בהגדלה של 100x, הגדר את ZDC (ראה טבלת חומרים) לטווח של ±30 מיקרומטר, והתחל מיקוד אוטומטי רציף. תקן ידנית את מישור המוקד לפי הצורך לפני ההדמיה.
   4. קבל זרם של תמונות בהגדלה של 100x. משכי זמן ארוכים עד 10 דקות ניתן להשיג עם ההתקנה המשמשת במחקר זה.
2. הדמיית מיטוGCaMP In vivo
   1. בצע את השלבים 4.1.1-4.1.2 לפי הצורך כדי להשיג את הפלואורסצנטיות הבסיסית של המיטוג-GCaMP בטווח הביניים עבור הטווח הדינמי של המצלמה¹⁴.
      הערה. עבור ההגדרה האופטית ששימשה במחקר זה, הגדר את לייזר ההדמיה של 488 ננומטר להגדרות הפלט הבאות: עוצמת לייזר = 20% והנחתה = 10. שנה את הגדרות הרכישה באופן הבא: רווח EM = 100 ורווח טרום מגבר = 2.
   2. לאחר שהמיטוכונדריה בנוירוט AVA ממוקמים באמצעות הפלואורסצנטיות של המיטוג'יMP, הגדר את ZDC כמתואר לעיל בשלב 3.3.
   3. קבל זרם של תמונות בהגדלה של 100x.

5. ניתוח זרם תמונות

1. פתחו את זרם התמונות בתוכנת תמונה מתאימה לניתוח ערכי הפיקסלים בסדרת תמונות (ראו טבלת חומרים).
2. בעזרת הכלי בחירת מצולע , הגדירו את אזור העניין התת-תאי (ROI) המכיל GCaMP או mitoGCaMP.
3. לחץ על ניתוח כלי > >- ROI Manager. במנהל החזר ההשקעה, לחץ על הוסף ולאחר מכן על עוד > מידה מרובה. בחלון Multi Measure, לחץ על OK כדי לאסוף באופן אוטומטי את עוצמות הפיקסלים הממוצעות, המינימליות והמרביות של החזר ההשקעה שהוגדר לעיל עבור כל מסגרת של זרם התמונה לצורך ניתוח נוסף.
   הערה. מומלץ לנרמל את עוצמת הפיקסלים הממוצעת (F_avg) לעוצמה המינימלית (F min) עבור כל החזר השקעה באמצעות היחס F_ממוצע / F_min כדי לקחת בחשבון הבדלים פלואורסצנטיים עקב מיקום במישור z. השליכו את זרמי התמונה עם תנועת תולעת במהלך ההדמיה מכיוון שהדבר ישפיע גם על מדידות הפלואורסצנטיות.

תוצאות

שני פרוטוקולים אלה מאפשרים רכישה מהירה של רמות Ca²⁺ דיפרנציאליות בתוך האזורים התת-תאיים והאברונים של נוירוטים בודדים in vivo עם רזולוציה מרחבית גבוהה. הפרוטוקול הראשון מאפשר מדידה של Ca²⁺ ציטופלזמי ברזולוציה טמפורלית ומרחבית גבוהה. זה מודגם כאן באמצעות ביטוי ספציפי לתא של GCaMP6f ...

Discussion

השיקול הראשון ביישום השיטה המתוארת כרוך בבחירת אינדיקטור Ca²⁺ עם מאפיינים אידיאליים לשאלת המחקר הנתונה. לאינדיקטורים ציטופלזמיים Ca 2+ יש בדרך כלל זיקה גבוהה ל- Ca 2+, והרגישות של אינדיקטורים אלה ל- Ca ²⁺ קשורה ביחס הפוך לקינטיקה (קצב הפעלה/כיבוי)^16,17

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x/1.40 Oil objective	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objective	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
Beam homogenizer	Andor Technologies		Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table	TMC		With vibration control
Disposable culture tubes	VWR	47729-572	13 mm x 100 mm
Environmental chamber	Thermo Scientific	3940	Set to 20 °C
Filter wheel or slider	ASI		For 25 mm diameter filters
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Worm strain
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Worm strain
GFP bandpass emission filter	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner	Andor Technologies		4 laser lines
ILE solid state 488 nm laser	Andor Technologies		50 mW
ImageJ	National Institutes of Health		Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope	Olympus		With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera	Andor Technologies
Low auto-fluorescence immersion oil	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Version 7.10.1
Microscope control box	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
pAS1	AddGene	194970	Plasmid
pBSKS	Stratagene
pCT61			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1	AddGene	194969	Plasmid
Polybead microspheres	Polysciences Inc.	00876-15	0.094 µm
Stability chamber	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Set to 15 °C
Stage controller	ASI		With filter wheel control
Standard microscope slide	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller	Olympus		I3-TPC
Z-drift corrector	Olympus		IX3-ZDC2