JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه الدراسة بروتوكولا محسنا لإنشاء الخلايا الليفية الأولية من أنسجة الجدرة التي يمكن أن توفر خلايا ليفية نقية وقابلة للحياة بشكل فعال ومطرد.

Abstract

تلعب الخلايا الليفية، وهي نوع الخلية الرئيسي في أنسجة الجدرة، دورا أساسيا في تكوين الجدرة وتطورها. إن عزل وثقافة الخلايا الليفية الأولية المشتقة من أنسجة الجدرة هي الأساس لمزيد من الدراسات حول الوظيفة البيولوجية والآليات الجزيئية للجدرة ، بالإضافة إلى استراتيجيات علاجية جديدة لعلاجها. الطريقة التقليدية للحصول على الخلايا الليفية الأولية لها قيود ، مثل الحالة الخلوية السيئة ، والاختلاط مع أنواع أخرى من الخلايا ، والتعرض للتلوث. تصف هذه الورقة بروتوكولا محسنا وقابلا للتكرار بسهولة يمكن أن يقلل من حدوث المشكلات المحتملة عند الحصول على الخلايا الليفية. في هذا البروتوكول ، يمكن ملاحظة الخلايا الليفية بعد 5 أيام من العزلة وتصل إلى ما يقرب من 80٪ التقاء بعد 10 أيام من الثقافة. بعد ذلك ، يتم تمرير الخلايا الليفية والتحقق منها باستخدام الأجسام المضادة PDGFRα و vimentin لمقايسات التألق المناعي والأجسام المضادة CD90 لقياس التدفق الخلوي. في الختام ، يمكن الحصول بسهولة على الخلايا الليفية من أنسجة الجدرة من خلال هذا البروتوكول ، والذي يمكن أن يوفر مصدرا وفيرا ومستقرا للخلايا في المختبر لأبحاث الجدرة.

Introduction

الجدرة ، وهو مرض تكاثري ليفي ، يتجلى في النمو المستمر للويحات التي غالبا ما تغزو الجلد الطبيعي المحيط دون قيود ذاتية وتسبب درجات مختلفة من الحكة والألم والأعباء التجميلية والنفسية للمرضى1. تلعب الخلايا الليفية ، وهي الخلايا الأولية المشاركة في الجدرة ، دورا أساسيا في تكوين هذا المرض وتطوره من خلال الانتشار المفرط ، وإنتاج المصفوفة الزائدة خارج الخلية ، والكولاجين غير المنظم2،3. ومع ذلك ، لا يزال التسبب في المرض الأساسي غير واضح ، ولا تزال هناك طريقة علاجية فعالة للجدرة ؛ لذلك ، هناك حاجة ملحة لمزيد من البحث 4,5.

نظرا لعدم وجود نموذج حيواني مثالي لأبحاث الجدرة في الجسم الحي 6،7 ، فإن بناء نموذج في المختبر عن طريق الحصول على الخلايا الليفية الأولية من أنسجة الجدرة يمكن أن يوفر جدوى وموثوقية لأبحاث الجدرة 2,6. الخلايا الأولية هي تلك المشتقة مباشرة من الأنسجة الحية ، ومن المسلم به عموما أن هذه الخلايا يمكن أن تشبه إلى حد كبير الحالة الفسيولوجية والخلفية الوراثية للعديد من الأفراد مقارنة بخطوط الخلايا 8,9. توفر زراعة الخلايا الأولية وسيلة قوية لدراسة نمو الخلايا واستقلابها ، بالإضافة إلى الأنماط الظاهرية الأخرى للخلايا.

في الوقت الحاضر ، هناك طريقتان للحصول على الخلايا الليفية الأولية: هضم الإنزيم وثقافة الزرع. ومع ذلك ، فقد تم تحديد العديد من العقبات التي تحول دون الحصول على الخلايا الليفية الأولية ، مثل خطر التلوث بالبكتيريا أو الفطريات المختلفة ، والاختلاط مع أنواع أخرى من الخلايا التي لا يمكن إزالتها بسهولة ، والفترة الطويلة لدورة الاستزراع ، والتغييرات اللاحقة في خصائص الخلية مقارنة بالخلايا الأصلية ، وما إلى ذلك9. لذلك ، فإن تطوير عملية مجدية وفعالة للحصول على الخلايا الليفية الأولية هو الأساس لمزيد من الدراسات والتطبيقات. تصف هذه الدراسة بروتوكولا محسنا لاستخراج الخلايا الليفية الأولية من أنسجة الجدرة التي يمكن أن توفر خلايا ليفية نقية وقابلة للحياة بشكل فعال ومطرد.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى الأمراض الجلدية ، الجامعة الطبية الجنوبية (2020081). تم الحصول على موافقة المريض المستنيرة قبل جمع الأنسجة من الأفراد.

1. التحضير

ملاحظة: يجب تنفيذ الإجراءات التالية في بيئة معقمة تحت خزانة السلامة البيولوجية.

  1. قم بإعداد وسط استزراع كامل عن طريق إضافة 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ محلول بنسلين-ستربتومايسين-أمفوتريسين ب (PSA) إلى وسط النسر المعدل (DMEM) عالي الجلوكوز من Dulbecco.
  2. تحضير محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع PSA عن طريق إضافة 1٪ PSA إلى 1x PBS. قم بإعداد PBS مع FBS بإضافة 1٪ FBS إلى 1x PBS.
  3. قم بإعداد العديد من المقصات والملقط والمشارط المعقمة عن طريق التعقيم.

2. الحصول على الأنسجة التي تمت إزالتها

  1. الحصول على الأنسجة من مرضى الجدرة من خلال الجراحة. اجمع أنسجة الجدرة الطازجة في كيس تعبئة معقم أو أنبوب طرد مركزي معقم ، وانقلها إلى خزانة السلامة البيولوجية في المختبر في أسرع وقت ممكن.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول ، كان حجم أنسجة الجدرة المكتسبة حوالي ~ 20 × 20 × 10 مم3 ، وقد يختلف الحجم حسب الجراحة.

3. العزلة

  1. أخرج أنسجة الجدرة باستخدام ملاقط معقمة ، وضعها في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل يحتوي على 10-25 مل من PBS مع 1٪ PSA لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بإعداد طبق من 6 آبار ، وأضف 4 مل من PBS مع 1٪ PSA إلى كل بئر. أخرج المنديل باستخدام ملاقط معقمة ، واغسله مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني مكمل ب 1٪ PSA. باستخدام ملقط معقم ، انقل الأنسجة بالتتابع من بئر إلى آخر.
  2. قم بإزالة طبقات البشرة الدهنية باستخدام مقص جراحي أو مشرط جراحي ، واترك طبقة الجلد دون مساس. تقليم وتشريح طبقة الأدمة إلى 3-5 مم2 قطعة مع مقص ، ونقل هذه القطع باستخدام ملقط معقم إلى البئر التالي ، وغسلها في برنامج تلفزيوني مع محلول PSA 1 ٪ مرة أخرى.

4. الثقافة

  1. ضع قطع أنسجة الأدمة في أطباق بتري باستخدام ملقط معقم. تأكد من أن عدد القطع بين 10 و 30 وأن المسافة بين كل قطعة >5 مم. ضع أطباق بتري رأسا على عقب في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة حتى تجف قطع المناديل قليلا وتلتصق بطبق بتري. بعد ذلك ، أضيفي DMEM المكمل ب 10٪ FBS و 1٪ PSA ، وضع أطباق بتري بعناية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: الخلايا الليفية هي مجموعة خلايا غير متجانسة شكليا ووظيفيا. بالنظر إلى هذا التعقيد ، يجب تنفيذ خطوات العزلة والثقافة بعناية ؛ حدد قطع الأنسجة الجلدية الجدرة بالتساوي ، واخلطي هذه القطع جيدا قبل وضعها في طبق بتري.
  2. بعد 3 أيام ، استبدل نصف المادة الطافية بوسط استزراع كامل. قم بتغيير وسط الثقافة كل 2-3 أيام. راقب الخلايا الليفية تحت المجهر بتكبير 40x كل يوم.
    ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات برفق. لا تحرك طبق بتري لمدة 2 أيام بعد العزل ، لأن قطع الأنسجة تستغرق وقتا للالتزام بأطباق بتري.
  3. عندما تصل الخلايا الليفية التي تنمو حول قطع الأنسجة إلى التقاء 90٪ تقريبا ، قم بإزالة قطع الأنسجة ووسط الثقافة. اغسل الخلايا الليفية باستخدام 1x PBS المعقم ، وأضف 2 مل من محلول 1x trypsin-EDTA المعقم إلى الألواح. احتضان الخلايا لمدة ~ 3-5 دقائق تقريبا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 مرطبة بنسبة 5٪. اضغط برفق على طبق الاستزراع ، وراقبه تحت المجهر. عندما تنفصل غالبية الخلايا عن اللوحة ، أضف 2 مل من الوسط الكامل لإنهاء عملية الهضم.
  4. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل ، وطرد مركزي الأنبوب عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية بعناية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في وسط كامل. بذر الخلايا الليفية في طبق زراعة الخلايا 9 سم ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 مرطبة بنسبة 5٪.

5. الصيانة والحفظ

  1. بعد حوالي 3-4 أيام ، عندما تنمو الخلايا الليفية إلى التقاء 80٪ ، كرر الخطوات 4.2-4.4 ، وقم بتمرير الخلايا الليفية بنسبة 1: 3. استخدم الخلايا الليفية المارة لمزيد من التجارب.
    ملاحظة: يجب إيقاف مزرعة الخلايا الليفية بعد 10 ممرات ، لأن الخلايا قد تبدأ في إظهار خصائص متغيرة مقارنة بالخلايا الأصلية.
  2. حفظ الخلايا المارة من P1-P3 بالتبريد في النيتروجين السائل لمزيد من الاستخدام.
    1. كرر الخطوات من 4.2 إلى 4.3. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي معقم 15 مل ، والطرد المركزي الأنبوب لمدة 3 دقائق في 300 × غرام. تخلص من المادة الطافية بعناية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط تجميد الخلايا الذي يحتوي على 90٪ FBS و 10٪ DMSO ، وانقل المعلق إلى أنابيب تبريد الخلية.
    2. انقل الخلايا إلى صندوق مجمد ، ثم ضع الصندوق المجمد في مجمد -80 درجة مئوية. بعد 1 يوم ، نقل الخلايا إلى النيتروجين السائل للحفاظ عليها على المدى الطويل.

6. تحديد الخلايا الليفية عن طريق تلطيخ المناعي

  1. ضع أغطية مستديرة في صفيحة من 24 بئرا ، واستزرع الخلايا الليفية المارة بتركيز 1 × 104 خلايا / بئر. عندما تصل الخلايا الليفية إلى التقاء 60٪ ، قم بإزالة وسط الثقافة. أضف 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد لإصلاح الخلايا الليفية لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، واغسل 3x باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة دقيقة واحدة في كل مرة.
    ملاحظة: عد عدد الخلايا باستخدام شريحة مقياس الدم تحت المجهر أو عداد الخلايا التلقائي.
  2. إزالة برنامج تلفزيوني ، واحتضان مع 0.5 ٪ تريتون X-100 لمدة 20 دقيقة لنفاذية أغشية الخلايا ، ثم غسل 3x مع برنامج تلفزيوني لمدة 1 دقيقة في كل مرة. أضف برنامج تلفزيوني مع 0.5٪ من ألبومين مصل الأبقار ، وانقعه لمدة 30 دقيقة. ثم قم بإزالته وإضافة الجسم المضاد PDGFR-α / vimentin المخفف في مخفف الأجسام المضادة عند 1: 1,000. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  3. في اليوم التالي ، قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي ، واغسل الخلايا 3x باستخدام PBS لمدة 3 دقائق ، وأضف الجسم المضاد الثانوي Alexa Fluor-555 الماعز المضاد للأرانب IgG المخفف بمخفف الأجسام المضادة في الساعة 1: 200 لينقع لمدة ساعة واحدة.
  4. إزالة الجسم المضاد الثانوي ، وغسل الخلايا 3x مع برنامج تلفزيوني. أخرج أغطية الأغطية المستديرة باستخدام ملقط ، وضعها على شرائح زجاجية ، وأضف 50 ميكرولتر من محلول 5 ميكروغرام / مل 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) لتلطيخ النوى الخلوية. احتفظ بالعينات في صندوق مبلل ومظلم ، وراقبها تحت مجهر مضان متحد البؤر بالليزر.
    ملاحظة: أضف مجموعة تحكم سلبية بدون جسم مضاد أولي ولكن مع جسم مضاد ثانوي لاستبعاد التلوين غير المحدد.

7. تحديد الخلايا الليفية عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. اجمع حبيبات الخلية في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 مل ، وأعد تعليقها ب 50 ميكرولتر من PBS تحتوي على 1٪ FBS. احتضان مع anti-CD90 لمدة 30 دقيقة في الظلام ، وإضافة عنصر تحكم isotype مضاد IgG إلى مجموعة التحكم. ثم أضف 200 ميكرولتر من PBS تحتوي على 1٪ FBS ، وطرد مركزي الأنبوب لمدة 10 دقائق عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية.
  2. قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 200 ميكرولتر من PBS تحتوي على 1٪ FBS. أعد تعليق التعليق وتصفيته من خلال مصفاة خلية (70 شبكة). أضف محلول مخزون 5 ميكروغرام / مل من DAPI عند 1: 100 إلى المرشح ، ثم احصل على النتائج عن طريق قياس التدفق الخلوي. قم بتعيين التشتت الأمامي (FSC) باعتباره الإحداثي والتشتت الجانبي (SSC) كإحداثي ، وقم بوضع دائرة حول محتوى الخلية الرئيسي. حدد تعداد الخلية ، وقم بتعيين phycoerythrin باعتباره الإحداثي والعدد كإحداثي للتحليل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يتم تلخيص الجدول الزمني للبروتوكول في الشكل 1A. يتم عرض بعض الصور التمثيلية لعملية العزل في الشكل 2 ؛ تمت إزالة طبقات البشرة والطبقات الدهنية بعناية ، وتم فصل طبقة الجلد إلى أجزاء صغيرة من 3-4 مم2 ، والتي تم تلقيحها في أطباق بتري.

كما هو موض...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يعد الحصول على الخلايا الليفية الأولية من أنسجة الجدرة أساسا حاسما لمزيد من البحث. حتى الآن ، كانت هناك طريقتان للحصول على الخلايا الليفية الأولية: هضم الإنزيم وزراعةالنباتات 11،12،13،14. ومع ذلك ، فإن كلتا الطريقتين التق?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

لا يوجد تضارب في المصالح للإعلان.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنح 81903189 و 82073418) ومؤسسة العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (رقم المنحة 202102020025).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL sterile centrifuge tubeJETBIOFILCFT002015
15 mL sterile centrifuge tubeJETBIOFIL8076
4% polyformaldehydeBeyotime BiotechnologyP0099Cell fixation
50 mL sterile centrifuge tubeJETBIOFIL8081Put keloid tissue
Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG AbcamAlexa Fluor 555 second antibody for immunofluorescence staining assay
Anti human CD90BioLegendB301002Identify the purity of fibroblasts
Antibody diluentBeyotime BiotechnologyP0262
Biological safety cabinet Thermo Scientific1300 series A2Isolation and culture cells
Bovine serum albuminaladdinB265993Blocking for immunofluorescence staining assay
Carbon dioxide incubatorESCOCCL-170B-8Using for culturing cells
Cell cryotubesCorning43513Store the cells in low temperature
centrifugal machineThermo FisherST 16RDiscard supernatant 
DAPIBeyotime BiotechnologyC1006Stain the cellular nucleus
DMSOMP Biomedicals196055Using for preserving cells
Dulbecco's modified eagle mediumGibcoC11995500BTCulture medium solution
Fetal bovine serumBI04-001-1A
Flow cytometerBDBD FACSCelestaObserving the identity of cells
frozen boxThermo Scientific 5100-0050
Inverted microscopeNikonECLIPSE Ts2
Laser confocal microscopeNikonAIR-HD25Observing the immunofluorescence staining assay
PDGFR-α antibodyCST3174TFirst antibody for immunofluorescence staining assay
Penicillin-streptomycin-Am solutionSolarbioP1410Add in culture medium solution to avoid contamination
petri dishJETBIOFIL7556Culture fibroblasts
Phosphate buffered saline solutionGibcoC10010500BTCulture medium solution
Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)Cell Signaling Technology5742SAs a control for flow cytometry
Round coverslipBiosharp801007Cell culture
Triton X 100SolarbioT8200Punch holes in the cell membrane
Trypsin-EDTAGibco25200072Used for passaging cells
Vimentin antibodyAbcamab8978First antibody for immunofluorescence staining assay

References

  1. Zhu, Y. Q., et al. Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes. Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883(2022).
  2. Feng, F., et al. Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 13, 906212(2022).
  3. Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).
  4. Wang, W., et al. Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid. Frontiers in Medicine. 9, 1043840(2022).
  5. Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic. British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).
  6. Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models. Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).
  7. Supp, D. M. Animal models for studies of keloid scarring. Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).
  8. Künzel, S. R., et al. Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation. Journal of Visualized Experiments. (149), e59858(2019).
  9. He, Y., et al. An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics. Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).
  10. Philippeos, C., et al. Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).
  11. Li, L., et al. Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition. Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733(2022).
  12. Zhou, B. Y., et al. Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).
  13. Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway. Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).
  14. Sato, C., et al. Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).
  15. Li, J., et al. Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts. Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).
  16. Wang, Q., et al. Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia. Redox Biology. 38, 101815(2021).
  17. Fan, C., et al. Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts. Frontiers in Genetics. 13, 798331(2022).
  18. Yao, L., et al. Temporal control of PDGFRα regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing. Cell Reports. 40 (7), 111192(2022).
  19. Domdey, M., et al. Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium. Stem Cell Research. 40, 102936(2022).
  20. Lin, Z., et al. Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease. FASEB Journal. 36 (12), e22625(2022).
  21. Korosec, A., et al. Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin. Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

197

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved