Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von primären dermalen Fibroblasten aus humanem Keloidgewebe

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Etablierung von primären Fibroblasten aus Keloidgeweben, die effektiv und stetig reine und lebensfähige Fibroblasten bereitstellen können.

Zusammenfassung

Fibroblasten, der wichtigste Zelltyp im Keloidgewebe, spielen eine wesentliche Rolle bei der Bildung und Entwicklung von Keloiden. Die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus Keloidgewebe sind die Grundlage für weitere Untersuchungen der biologischen Funktion und der molekularen Mechanismen von Keloiden sowie für neue therapeutische Strategien zu ihrer Behandlung. Die traditionelle Methode zur Gewinnung primärer Fibroblasten hat Einschränkungen, wie z. B. einen schlechten Zellzustand, eine Vermischung mit anderen Zelltypen und eine Anfälligkeit für Kontamination. In diesem Artikel wird ein optimiertes und leicht reproduzierbares Protokoll beschrieben, das das Auftreten möglicher Probleme bei der Gewinnung von Fibroblasten reduzieren könnte. In diesem Protokoll können Fibroblasten 5 Tage nach der Isolierung beobachtet werden und erreichen nach 10 Tagen Kultur eine Konfluenz von fast 80 %. Anschließend werden die Fibroblasten mit PDGFRα- und Vimentin-Antikörpern für Immunfluoreszenz-Assays und CD90-Antikörpern für die Durchflusszytometrie verifiziert und verifiziert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Fibroblasten aus Keloidgewebe durch dieses Protokoll leicht gewonnen werden können, was eine reichhaltige und stabile Quelle von Zellen im Labor für die Keloidforschung darstellen kann.

Einleitung

Keloid, eine fibroproliferative Erkrankung, manifestiert sich durch das kontinuierliche Wachstum von Plaques, die oft ohne Selbstbeschränkung in die umgebende normale Haut eindringen und bei den Patienten verschiedene Grade von Juckreiz, Schmerzen sowie kosmetischen und psychischen Belastungen verursachen¹. Fibroblasten, die primären Zellen, die an Keloiden beteiligt sind, spielen eine wesentliche Rolle bei der Entstehung und Entwicklung dieser Krankheit durch übermäßige Proliferation, redundante extrazelluläre Matrixproduktion und desorganisierte Kollagene ^2,3. Die zugrundeliegende Pathogenese ist jedoch noch unklar, und es fehlt noch an einer wirksamen therapeutischen Methode für Keloide; Daher besteht dringender Bedarf an weiterer Forschung ^4,5.

Da es kein ideales Tiermodell für die Keloidforschung in vivo gibt ^6,7, kann der Aufbau eines In-vitro-Modells durch die Gewinnung von primären Fibroblasten aus Keloidgeweben die Durchführbarkeit und Zuverlässigkeit für die Keloidforschung bieten ^2,6. Primärzellen sind solche, die direkt aus lebendem Gewebe stammen, und es ist allgemein anerkannt, dass diese Zellen dem physiologischen Zustand und dem genetischen Hintergrund mehrerer Individuen im Vergleich zu Zelllinien ähnlicher sein können ^8,9. Die Kultivierung von Primärzellen bietet ein leistungsfähiges Mittel, um das Wachstum und den Stoffwechsel von Zellen sowie andere Zellphänotypen zu untersuchen.

Derzeit gibt es zwei Methoden zur Gewinnung von primären Fibroblasten: den Enzymverdau und die Explantatkultur. Es wurden jedoch mehrere Hindernisse für die Gewinnung von primären Fibroblasten identifiziert, wie z. B. das Risiko einer Kontamination durch verschiedene Bakterien oder Pilze, die Vermischung mit anderen Zelltypen, die nicht leicht zu entfernen sind, die lange Dauer des Kulturzyklus, die anschließenden Veränderungen der Zelleigenschaften im Vergleich zu den ursprünglichen Zellen usw^{. 9}. Daher ist die Entwicklung eines praktikablen und effektiven Verfahrens zur Gewinnung primärer Fibroblasten die Grundlage für weitere Studien und Anwendungen. Diese Studie beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Extraktion von primären Fibroblasten aus Keloidgeweben, das effektiv und stetig reine und lebensfähige Fibroblasten bereitstellen kann.

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Protokoll

Diese Studie wurde vom institutionellen Prüfungsausschuss des Dermatologischen Krankenhauses der Southern Medical University (2020081) genehmigt. Die informierte Einwilligung der Patienten wurde eingeholt, bevor Gewebe von den Personen entnommen wurde.

1. Vorbereitung

HINWEIS: Die folgenden Verfahren sollten in einer sterilen Umgebung unter einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.

1. Bereiten Sie ein vollständiges Nährmedium vor, indem Sie 10 % fötales Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin-Amphotericin-B-Lösung (PSA) zu Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt hinzufügen.
2. Bereiten Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit PSA zu, indem Sie 1 % PSA in 1x PBS geben. Bereiten Sie PBS mit FBS zu, indem Sie 1% FBS zu 1x PBS hinzufügen.
3. Bereiten Sie mehrere sterilisierte Scheren, Pinzetten und Skalpelle durch Autoklavieren vor.

2. Entnahme von entferntem Gewebe

1. Entnahme von Gewebe von Keloidpatienten durch Operation. Sammeln Sie das frische Keloidgewebe in einem sterilen Verpackungsbeutel oder sterilen Zentrifugenröhrchen und überführen Sie es so schnell wie möglich in eine biologische Sicherheitswerkbank im Labor.
   HINWEIS: In diesem Protokoll betrug die Größe des erworbenen Keloidgewebes ungefähr ~20 x 20 x 10 mm³, und die Größe kann je nach Operation variieren.

3. Isolierung

1. Nehmen Sie das Keloidgewebe mit einer sterilen Pinzette heraus und legen Sie es 10 Minuten lang in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das 10-25 ml PBS mit 1 % PSA enthält. Bereiten Sie dann eine 6-Well-Platte vor und geben Sie 4 ml PBS, ergänzt mit 1% PSA, in jede Well. Nehmen Sie das Taschentuch mit einer sterilisierten Pinzette heraus und waschen Sie es zweimal mit PBS, das mit 1% PSA ergänzt ist. Übertragen Sie das Gewebe mit einer sterilen Pinzette nacheinander von einer Vertiefung in die nächste.
2. Entfernen Sie die Fett- und Epidermisschichten mit einer chirurgischen Schere oder einem chirurgischen Skalpell und lassen Sie die Dermisschicht unberührt. Schneiden und präparieren Sie die Dermisschicht mit einer Schere in 3-5 mm² Stücke, übertragen Sie diese Stücke mit einer sterilen Pinzette in die nächste Vertiefung und waschen Sie sie erneut in PBS mit 1%iger PSA-Lösung.

4. Kultur

1. Legen Sie die Dermisgewebestücke mit sterilisierten Pinzetten in Petrischalen; Achten Sie darauf, dass die Stückzahl zwischen 10 und 30 liegt und der Abstand zwischen den einzelnen Teilen >5 mm beträgt. Stellen Sie die Petrischalen kopfüber in einen 5% CO₂ -Inkubator bei 37 °C für 30-60 min, bis die Gewebestücke etwas getrocknet sind und an der Petrischale haften. Dann wird DMEM mit 10 % FBS und 1 % PSA versetzt und die Petrischalen vorsichtig in einen 5 % CO₂ -Inkubator bei 37 °C gestellt.
   HINWEIS: Fibroblasten sind eine morphologisch und funktionell heterogene Zellpopulation. In Anbetracht dieser Komplexität sollten die Isolations- und Kulturschritte mit Vorsicht durchgeführt werden. Wählen Sie die keloiden Hautgewebestücke gleichmäßig aus und mischen Sie diese Stücke gut, bevor Sie sie in die Petrischale legen.
2. Nach 3 Tagen wird die Hälfte des Überstandes durch ein vollständiges Nährmedium ersetzt. Wechseln Sie das Nährmedium alle 2-3 Tage. Beobachten Sie die Fibroblasten täglich unter dem Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung.
   HINWEIS: Alle Schritte sollten vorsichtig ausgeführt werden. Bewegen Sie die Petrischale nach der Isolierung 2 Tage lang nicht, da die Gewebestücke Zeit brauchen, um an den Petrischalen zu haften.
3. Wenn die Fibroblasten, die um die Gewebestücke herum wachsen, eine Konfluenz von etwa 90 % erreicht haben, entfernen Sie die Gewebestücke und das Kulturmedium. Waschen Sie die Fibroblasten mit sterilem 1x PBS und geben Sie 2 ml sterile 1x Trypsin-EDTA-Lösung auf die Platten. Inkubieren Sie die Zellen für ca. ~3-5 min bei 37 °C in einem befeuchteten 5% CO_{2 -} Inkubator. Klopfen Sie vorsichtig auf die Kulturschale und beobachten Sie sie unter dem Mikroskop. Wenn sich die Mehrheit der Zellen von der Platte löst, fügen Sie 2 ml des vollständigen Mediums hinzu, um den Verdauungsprozess zu beenden.
4. Die Zellsuspension wird in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und das Röhrchen bei 300 × g 3 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie das Zellpellet im vollständigen Medium. Die Fibroblasten werden in eine 9-cm-Zellkulturschale ausgesät und bei 37 °C in einem befeuchteten 5%igen CO₂ -Inkubator inkubiert.

5. Wartung und Konservierung

1. Etwa 3-4 Tage später, wenn die Fibroblasten auf 80% Konfluenz angewachsen sind, wiederholen Sie die Schritte 4.2-4.4 und passieren Sie die Fibroblasten in einem Verhältnis von 1:3. Verwenden Sie die durchgelassenen Fibroblasten für weitere Experimente.
   HINWEIS: Die Fibroblastenkultur sollte nach 10 Passagen abgebrochen werden, da die Zellen im Vergleich zu den ursprünglichen Zellen veränderte Eigenschaften aufweisen können.
2. Kryokonservierung der durchgelassenen Zellen von P1-P3 in flüssigem Stickstoff für die weitere Verwendung.
   1. Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 4.3. Die Zellsuspension wird in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und das Röhrchen 3 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig, resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Zellgefriermedium, das 90 % FBS und 10 % DMSO enthält, und überführen Sie die Suspension in Zellkryoröhrchen.
   2. Legen Sie die Zellen in eine gefrorene Schachtel und legen Sie die gefrorene Schachtel dann in einen Gefrierschrank bei −80 °C. Nach 1 Tag werden die Zellen zur Langzeitkonservierung in flüssigen Stickstoff überführt.

6. Identifizierung von Fibroblasten durch Immunfluoreszenzfärbung

1. Legen Sie runde Deckgläser in eine 24-Well-Platte und kultivieren Sie die durchgelassenen Fibroblasten bei einer Konzentration von 1 × 10⁴ Zellen/Well. Wenn die Fibroblasten eine Konfluenz von 60 % erreicht haben, entfernen Sie das Kulturmedium. Fügen Sie 1 ml 4%iges Paraformaldehyd hinzu, um die Fibroblasten 20 Minuten lang bei Raumtemperatur zu fixieren, und waschen Sie sie 3x mit PBS für jeweils 1 Minute.
   HINWEIS: Zählen Sie die Anzahl der Zellen, indem Sie einen Hämozytometer-Objektträger unter einem Mikroskop oder einen automatischen Zellzähler verwenden.
2. Entfernen Sie das PBS, inkubieren Sie es mit 0,5 % Triton X-100 für 20 Minuten für die Permeabilisierung der Zellmembranen und waschen Sie es dann 3x mit PBS für jeweils 1 Minute. PBS mit 0,5 % Rinderserumalbumin hinzufügen und 30 Minuten einweichen lassen. Entfernen Sie es dann und fügen Sie den PDGFR-α/Vimentin-Antikörper hinzu, der in einem Verdünnungsmittel von 1:1.000 verdünnt ist. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
3. Entfernen Sie am nächsten Tag den primären Antikörper, waschen Sie die Zellen 3x mit PBS für 3 Minuten und fügen Sie den sekundären Antikörper Alexa Fluor-555 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG hinzu, der mit dem Antikörperverdünnungsmittel bei 1:200 verdünnt ist, um ihn 1 h lang einzuweichen.
4. Entfernen Sie den sekundären Antikörper und waschen Sie die Zellen 3x mit PBS. Nehmen Sie die runden Deckgläser mit einer Pinzette heraus, legen Sie sie auf Objektträger und fügen Sie 50 μl 5 μg/ml 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Lösung hinzu, um die Zellkerne zu färben. Bewahren Sie die Proben in einer feuchten, dunklen Box auf und beobachten Sie sie unter einem konfokalen Laserfluoreszenzmikroskop.
   HINWEIS: Fügen Sie eine negative Kontrollgruppe ohne Primärantikörper, aber mit einem Sekundärantikörper hinzu, um eine unspezifische Färbung auszuschließen.

7. Identifizierung von Fibroblasten mittels Durchflusszytometrie

1. Das Zellpellet wird in ein steriles 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen aufgefangen und mit 50 μl PBS mit 1 % FBS resuspendiert. Inkubieren Sie mit Anti-CD90 für 30 Minuten im Dunkeln und fügen Sie der Kontrollgruppe eine Anti-IgG-Isotyp-Kontrolle hinzu. Dann werden 200 μl PBS mit 1 % FBS zugegeben und das Röhrchen 10 Minuten lang bei 300 × g bei 4 °C zentrifugiert.
2. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 200 μl PBS mit 1 % FBS hinzu. Resuspendieren und filtrieren Sie die Suspension durch ein Zellsieb (70 mesh). Eine 5 μg/ml Stammlösung von DAPI im Verhältnis 1:100 in das Filtrat geben und dann die Ergebnisse durch Durchflusszytometrie erfassen. Legen Sie die Vorwärtsstreuung (FSC) als Abszisse und die Seitenstreuung (SSC) als Ordinate fest, und kreisen Sie die Hauptzellenpopulation ein. Wählen Sie die Zellpopulation aus, und legen Sie das Phycoerythrin als Abszisse und die Anzahl als Ordinate für die Analyse fest.

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Ergebnisse

Der zeitliche Ablauf des Protokolls ist in Abbildung 1A zusammengefasst. Einige repräsentative Bilder des Isolationsprozesses sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Epidermis- und Fettschichten wurden vorsichtig entfernt, und die Dermisschicht wurde in kleine Fragmente von 3-4 mm² getrennt, die in die Petrischalen inokuliert wurden.

Wie in Abbildung 3A gezeigt, wurden 5 Tage nach der Verarbe...

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Diskussion

Die Gewinnung von primären Fibroblasten aus Keloidgewebe ist eine wichtige Grundlage für die weitere Forschung. Bisher gab es zwei Methoden zur Gewinnung primärer Fibroblasten: Enzymverdau und Explantatkultur^11,12,13,14. Beide traditionellen Methoden haben jedoch Einschränkungen, wie z. B. die Anfälligkeit für Kontamination, die Vermischung mit anderen Zelltypen, eine lange Kulturzeit und...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	CFT002015
15 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	8076
4% polyformaldehyde	Beyotime Biotechnology	P0099	Cell fixation
50 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	8081	Put keloid tissue
Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG	Abcam	Alexa Fluor 555	second antibody for immunofluorescence staining assay
Anti human CD90	BioLegend	B301002	Identify the purity of fibroblasts
Antibody diluent	Beyotime Biotechnology	P0262
Biological safety cabinet	Thermo Scientific	1300 series A2	Isolation and culture cells
Bovine serum albumin	aladdin	B265993	Blocking for immunofluorescence staining assay
Carbon dioxide incubator	ESCO	CCL-170B-8	Using for culturing cells
Cell cryotubes	Corning	43513	Store the cells in low temperature
centrifugal machine	Thermo Fisher	ST 16R	Discard supernatant
DAPI	Beyotime Biotechnology	C1006	Stain the cellular nucleus
DMSO	MP Biomedicals	196055	Using for preserving cells
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco	C11995500BT	Culture medium solution
Fetal bovine serum	BI	04-001-1A
Flow cytometer	BD	BD FACSCelesta	Observing the identity of cells
frozen box	Thermo Scientific	5100-0050
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2
Laser confocal microscope	Nikon	AIR-HD25	Observing the immunofluorescence staining assay
PDGFR-α antibody	CST	3174T	First antibody for immunofluorescence staining assay
Penicillin-streptomycin-Am solution	Solarbio	P1410	Add in culture medium solution to avoid contamination
petri dish	JETBIOFIL	7556	Culture fibroblasts
Phosphate buffered saline solution	Gibco	C10010500BT	Culture medium solution
Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)	Cell Signaling Technology	5742S	As a control for flow cytometry
Round coverslip	Biosharp	801007	Cell culture
Triton X 100	Solarbio	T8200	Punch holes in the cell membrane
Trypsin-EDTA	Gibco	25200072	Used for passaging cells
Vimentin antibody	Abcam	ab8978	First antibody for immunofluorescence staining assay