Aislamiento, cultivo y caracterización de fibroblastos dérmicos primarios a partir de tejido queloide humano

Resumen

Este estudio describe un protocolo optimizado para establecer fibroblastos primarios a partir de tejidos queloides que puedan proporcionar fibroblastos puros y viables de manera efectiva y constante.

Resumen

Los fibroblastos, el principal tipo de célula en el tejido queloide, juegan un papel esencial en la formación y desarrollo de los queloides. El aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios derivados del tejido queloide son la base para futuros estudios de la función biológica y los mecanismos moleculares de los queloides, así como nuevas estrategias terapéuticas para su tratamiento. El método tradicional de obtención de fibroblastos primarios tiene limitaciones, como el mal estado celular, la mezcla con otros tipos de células y la susceptibilidad a la contaminación. En este trabajo se describe un protocolo optimizado y fácilmente reproducible que podría reducir la aparición de posibles problemas a la hora de obtener fibroblastos. En este protocolo, los fibroblastos se pueden observar 5 días después del aislamiento y alcanzan casi el 80% de confluencia después de 10 días de cultivo. A continuación, los fibroblastos se hacen pasar y se verifican utilizando anticuerpos PDGFRα y vimentina para ensayos de inmunofluorescencia y anticuerpos CD90 para citometría de flujo. En conclusión, los fibroblastos del tejido queloide se pueden adquirir fácilmente a través de este protocolo, lo que puede proporcionar una fuente abundante y estable de células en el laboratorio para la investigación de queloides.

Introducción

El queloide, una enfermedad fibroproliferativa, se manifiesta como el crecimiento continuo de placas que a menudo invaden la piel normal circundante sin autolimitación y causan diversos grados de picazón, dolor y cargas cosméticas y psicológicas para los pacientes¹. Los fibroblastos, las principales células implicadas en los queloides, desempeñan un papel esencial en la formación y desarrollo de esta enfermedad a través de la proliferación excesiva, la producción redundante de matriz extracelular y el desorden de los colágenos ^2,3. Sin embargo, la patogenia subyacente sigue sin estar clara y aún no existe un método terapéutico eficaz para el queloide; Por lo tanto, existe una necesidad urgente de más investigación ^4,5.

Dado que no existe un modelo animal ideal para la investigación de queloides in vivo ^6,7, la construcción de un modelo in vitro mediante la adquisición de fibroblastos primarios de tejidos queloides puede ofrecer viabilidad y fiabilidad para la investigación de queloides ^2,6. Las células primarias son aquellas derivadas directamente de tejidos vivos, y generalmente se reconoce que estas células pueden parecerse más al estado fisiológico y al fondo genético de múltiples individuos en comparación con las líneas celulares ^8,9. El cultivo de células primarias proporciona un medio poderoso para estudiar el crecimiento y el metabolismo de las células, así como otros fenotipos celulares.

En la actualidad, existen dos métodos para la adquisición de fibroblastos primarios: la digestión enzimática y el cultivo de explantes. Sin embargo, se han identificado varios obstáculos para la obtención de fibroblastos primarios, como el riesgo de contaminación por diversas bacterias u hongos, la mezcla con otros tipos de células que no se eliminan fácilmente, el largo período del ciclo de cultivo, los cambios posteriores en las características celulares en comparación con las células originales, etc.⁹. Por lo tanto, el desarrollo de un proceso factible y eficaz para la obtención de fibroblastos primarios es la base para futuros estudios y aplicaciones. Este estudio describe un protocolo optimizado para extraer fibroblastos primarios de tejidos queloides que pueden proporcionar fibroblastos puros y viables de manera efectiva y constante.

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Protocolo

Este estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional del Hospital de Dermatología de la Universidad Médica del Sur (2020081). Se obtuvo el consentimiento informado del paciente antes de que se recolectaran tejidos de los individuos.

1. Preparación

NOTA: Los siguientes procedimientos deben realizarse en un ambiente estéril bajo una cabina de seguridad biológica.

1. Prepare un medio de cultivo completo añadiendo suero fetal bovino (FBS) al 10 % y solución de penicilina, estreptomicina y anfotericina B (PSA) al medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa.
2. Prepare una solución salina tamponada con fosfato (PBS) con PSA agregando PSA al 1% en 1x PBS. Prepare PBS con FBS agregando 1% de FBS a 1x PBS.
3. Prepare varias tijeras, pinzas y bisturíes esterilizados en autoclave.

2. Obtención de tejidos extraídos

1. Obtener tejidos de pacientes queloides a través de cirugía. Recoja los tejidos queloides frescos en una bolsa de embalaje estéril o en un tubo de centrífuga estéril y transfiéralos a un gabinete de seguridad biológica en el laboratorio lo antes posible.
   NOTA: En este protocolo, el tamaño del tejido queloide adquirido fue de aproximadamente ~20 x 20 x 10 mm³, y el tamaño puede variar dependiendo de la cirugía.

3. Aislamiento

1. Extraiga el tejido queloide con pinzas estériles y colóquelo en un tubo de centrífuga estéril de 50 ml que contenga 10-25 ml de PBS con PSA al 1% durante 10 min. Luego, prepare una placa de 6 pocillos y agregue 4 ml de PBS suplementado con PSA al 1% a cada pocillo. Saque el pañuelo con pinzas esterilizadas y lávelo dos veces con PBS suplementado con PSA al 1%. Con pinzas estériles, transfiera el tejido secuencialmente de un pocillo a otro.
2. Retire las capas adiposas y de la epidermis con unas tijeras quirúrgicas o un bisturí quirúrgico y deje intacta la capa de la dermis. Recorte y diseccione la capa dérmica en 2 piezas de 3-5 mm con unas tijeras, transfiera estas piezas con^pinzas estériles al siguiente pocillo y lávelas en PBS con una solución de PSA al 1% nuevamente.

4. Cultura

1. Coloque los trozos de tejido dérmico en placas de Petri con pinzas esterilizadas; Asegúrese de que el número de piezas esté entre 10 y 30 y que la distancia entre cada pieza sea de >5 mm. Coloque las placas de Petri boca abajo en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C durante 30-60 min hasta que los trozos de tejido se sequen un poco y se peguen a la placa de Petri. A continuación, añadir DMEM suplementado con un 10% de FBS y un 1% de PSA, y colocar con cuidado las placas de Petri en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C.
   NOTA: Los fibroblastos son una población celular morfológica y funcionalmente heterogénea. Teniendo en cuenta esta complejidad, los pasos de aislamiento y cultivo deben realizarse con cuidado; seleccione las piezas de tejido dérmico queloide de manera uniforme y mezcle bien estas piezas antes de colocarlas en la placa de Petri.
2. Después de 3 días, reemplace la mitad del sobrenadante con un medio de cultivo completo. Cambie el medio de cultivo cada 2-3 días. Observe los fibroblastos bajo un microscopio con un aumento de 40x todos los días.
   NOTA: Todos los pasos deben realizarse suavemente. No mueva la placa de Petri durante 2 días después del aislamiento, ya que las piezas de tejido tardan en adherirse a las placas de Petri.
3. Cuando los fibroblastos que crecen alrededor de las piezas de tejido alcancen aproximadamente el 90% de confluencia, retire las piezas de tejido y el medio de cultivo. Lave los fibroblastos con 1x PBS estéril y agregue 2 ml de solución estéril de tripsina-EDTA 1x a las placas. Incubar las células durante aproximadamente ~3-5 min a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ . Golpee suavemente la placa de cultivo y obsérvela bajo un microscopio. Cuando la mayoría de las células se desprendan de la placa, agregue 2 ml de medio completo para finalizar el proceso de digestión.
4. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml y centrifugue el tubo a 300 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante con cuidado y vuelva a suspender el gránulo celular en medio completo. Siembre los fibroblastos en una placa de cultivo celular de 9 cm e incube a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ .

5. Mantenimiento y conservación

1. Aproximadamente 3-4 días después, cuando los fibroblastos hayan crecido hasta el 80% de confluencia, repita los pasos 4.2-4.4 y pase los fibroblastos en una proporción de 1:3. Utilice los fibroblastos pasados para realizar más experimentos.
   NOTA: El cultivo de fibroblastos debe detenerse después de 10 pasadas, ya que las células pueden comenzar a mostrar características modificadas en comparación con las células originales.
2. Criopreservar las células transitadas de P1-P3 en nitrógeno líquido para su uso posterior.
   1. Repita los pasos 4.2-4.3. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml y centrifugue el tubo durante 3 minutos a 300 × g. Deseche el sobrenadante con cuidado, vuelva a suspender el gránulo celular en 1 ml de medio de congelación celular que contenga 90% de FBS y 10% de DMSO, y transfiera la suspensión a criotubos celulares.
   2. Mueva las células a una caja congelada y luego coloque la caja congelada en un congelador a -80 °C. Después de 1 día, transfiera las células a nitrógeno líquido para su conservación a largo plazo.

6. Identificación de fibroblastos mediante tinción de inmunofluorescencia

1. Coloque cubreobjetos redondos en una placa de 24 pocillos y cultive los fibroblastos pasados a una concentración de 1 × 10⁴ células/pocillo. Cuando los fibroblastos alcancen el 60% de confluencia, retire el medio de cultivo. Agregue 1 ml de paraformaldehído al 4% para fijar los fibroblastos durante 20 minutos a temperatura ambiente y lave 3 veces con PBS durante 1 minuto cada vez.
   NOTA: Cuente el número de células utilizando un portaobjetos de hemocitómetro bajo un microscopio o un contador automático de células.
2. Retire el PBS, incube con Triton X-100 al 0,5% durante 20 minutos para la permeabilización de las membranas celulares y luego lave 3 veces con PBS durante 1 minuto cada vez. Añadir PBS con albúmina sérica bovina al 0,5% y remojar durante 30 min. A continuación, retíralo y añade el anticuerpo PDGFR-α/vimentina diluido en diluyente de anticuerpos a 1:1.000. Incubar durante la noche a 4 °C.
3. Al día siguiente, retire el anticuerpo primario, lave las células 3 veces con PBS durante 3 minutos y agregue el anticuerpo secundario Alexa Fluor-555 cabra anti-conejo IgG diluido con diluyente de anticuerpos a 1:200 para remojar durante 1 h.
4. Retire el anticuerpo secundario y lave las células 3 veces con PBS. Saque los cubreobjetos redondos con fórceps, colóquelos en portaobjetos de vidrio y agregue 50 μL de solución de 5 μg/ml de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para teñir los núcleos celulares. Mantenga las muestras en una caja húmeda y oscura y obsérvelas bajo un microscopio láser de fluorescencia confocal.
   NOTA: Agregue un grupo de control negativo sin un anticuerpo primario pero con un anticuerpo secundario para excluir la tinción inespecífica.

7. Identificación de fibroblastos por citometría de flujo

1. Recoja el gránulo de celda en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml y vuelva a suspender con 50 μl de PBS que contenga 1% de FBS. Incubar con anti-CD90 durante 30 min en la oscuridad y añadir un control de isotipo anti-IgG al grupo de control. A continuación, añadir 200 μL de PBS que contenga un 1% de FBS y centrifugar el tubo durante 10 min a 300 × g a 4 °C.
2. Retire el sobrenadante y agregue 200 μL de PBS que contenga 1% de FBS. Vuelva a suspender y filtre la suspensión a través de un colador de celdas (malla 70). Agregue una solución madre de 5 μg/mL de DAPI a 1:100 al filtrado y luego adquiera los resultados por citometría de flujo. Establezca la dispersión directa (FSC) como la abscisa y la dispersión lateral (SSC) como la ordenada, y encierre en un círculo la población de células principal. Seleccione la población celular y establezca la ficoeritrina como la abscisa y el recuento como la ordenada para el análisis.

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Resultados

La cronología del protocolo se resume en la Figura 1A. En la Figura 2 se muestran algunas imágenes representativas del proceso de aislamiento; las capas de epidermis y adiposa se eliminaron cuidadosamente, y la capa de dermis se separó en pequeños fragmentos de 3-4^mm2, que se inocularon en las placas de Petri.

Como se muestra en la Figura 3A, se observaron varias excrecencias de fibrobl...

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Discusión

La obtención de fibroblastos primarios a partir de tejidos queloides es una base fundamental para futuras investigaciones. Hasta el momento, existen dos métodos para la adquisición de fibroblastos primarios: la digestión enzimática y el cultivo de explantes^11,12,13,14. Sin embargo, ambos métodos tradicionales tienen limitaciones, como la susceptibilidad a la contaminación, la mezcla con ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	CFT002015
15 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	8076
4% polyformaldehyde	Beyotime Biotechnology	P0099	Cell fixation
50 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	8081	Put keloid tissue
Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG	Abcam	Alexa Fluor 555	second antibody for immunofluorescence staining assay
Anti human CD90	BioLegend	B301002	Identify the purity of fibroblasts
Antibody diluent	Beyotime Biotechnology	P0262
Biological safety cabinet	Thermo Scientific	1300 series A2	Isolation and culture cells
Bovine serum albumin	aladdin	B265993	Blocking for immunofluorescence staining assay
Carbon dioxide incubator	ESCO	CCL-170B-8	Using for culturing cells
Cell cryotubes	Corning	43513	Store the cells in low temperature
centrifugal machine	Thermo Fisher	ST 16R	Discard supernatant
DAPI	Beyotime Biotechnology	C1006	Stain the cellular nucleus
DMSO	MP Biomedicals	196055	Using for preserving cells
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco	C11995500BT	Culture medium solution
Fetal bovine serum	BI	04-001-1A
Flow cytometer	BD	BD FACSCelesta	Observing the identity of cells
frozen box	Thermo Scientific	5100-0050
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2
Laser confocal microscope	Nikon	AIR-HD25	Observing the immunofluorescence staining assay
PDGFR-α antibody	CST	3174T	First antibody for immunofluorescence staining assay
Penicillin-streptomycin-Am solution	Solarbio	P1410	Add in culture medium solution to avoid contamination
petri dish	JETBIOFIL	7556	Culture fibroblasts
Phosphate buffered saline solution	Gibco	C10010500BT	Culture medium solution
Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)	Cell Signaling Technology	5742S	As a control for flow cytometry
Round coverslip	Biosharp	801007	Cell culture
Triton X 100	Solarbio	T8200	Punch holes in the cell membrane
Trypsin-EDTA	Gibco	25200072	Used for passaging cells
Vimentin antibody	Abcam	ab8978	First antibody for immunofluorescence staining assay