בידוד, תרבית ואפיון פיברובלסטים עוריים ראשוניים מרקמת קלואיד אנושית

Summary

מחקר זה מתאר פרוטוקול אופטימלי לביסוס פיברובלסטים ראשוניים מרקמות קלואידיות שיכולים לספק פיברובלסטים טהורים ויציבים ביעילות ובהתמדה.

Abstract

פיברובלסטים, סוג התא העיקרי ברקמת קלואיד, ממלאים תפקיד חיוני בהיווצרות והתפתחות קלואידים. הבידוד והתרבית של פיברובלסטים ראשוניים שמקורם ברקמה קלואידית הם הבסיס למחקרים נוספים על הפונקציה הביולוגית והמנגנונים המולקולריים של קלואידים, כמו גם אסטרטגיות טיפוליות חדשות לטיפול בהם. לשיטה המסורתית להשגת פיברובלסטים ראשוניים יש מגבלות, כגון מצב תאי ירוד, ערבוב עם סוגים אחרים של תאים ורגישות לזיהום. מאמר זה מתאר פרוטוקול ממוטב וקל לשחזור שיכול להפחית את התרחשותן של בעיות אפשריות בעת השגת פיברובלסטים. בפרוטוקול זה, ניתן לצפות בפיברובלסטים 5 ימים לאחר הבידוד ולהגיע לכמעט 80% מפגש לאחר 10 ימי תרבית. לאחר מכן, הפיברובלסטים עוברים ומאומתים באמצעות נוגדני PDGFRα ווימנטין לבדיקות אימונופלואורסנציה ונוגדני CD90 לציטומטריית זרימה. לסיכום, פיברובלסטים מרקמה קלואידית ניתן לרכוש בקלות באמצעות פרוטוקול זה, אשר יכול לספק מקור שופע ויציב של תאים במעבדה למחקר קלואיד.

Introduction

קלואיד, מחלה פיברופרוליפרטיבית, מתבטאת בצמיחה מתמשכת של פלאקים שלעתים קרובות פולשים לעור הרגיל שמסביב ללא הגבלה עצמית וגורמים לדרגות שונות של גירוד, כאב ונטל קוסמטי ופסיכולוגי לחולים¹. פיברובלסטים, התאים העיקריים המעורבים בקלואידים, ממלאים תפקיד חיוני בהיווצרות ובהתפתחות של מחלה זו באמצעות התרבות יתר, ייצור מטריצות חוץ-תאיות מיותרות וקולגן^{לא מאורגן 2,3}. עם זאת, הפתוגנזה הבסיסית נותרה לא ברורה, ושיטה טיפולית יעילה לקלואיד עדיין חסרה; לכן, יש צורך דחוף במחקר נוסף ^4,5.

מכיוון שאין מודל אידיאלי בבעלי חיים למחקר קלואיד in vivo ^6,7, בניית מודל במבחנה על ידי רכישת פיברובלסטים ראשוניים מרקמות קלואידיות יכולה להציע היתכנות ואמינות למחקר קלואיד ^2,6. תאים ראשוניים הם אלה שמקורם ישירות ברקמה חיה, וידוע בדרך כלל כי תאים אלה יכולים להידמות יותר למצב הפיזיולוגי ולרקע הגנטי של אנשים רבים בהשוואה לשורות תאים ^8,9. טיפוח תאים ראשוניים מספק אמצעי רב עוצמה לחקר הצמיחה והמטבוליזם של תאים, כמו גם פנוטיפים אחרים של תאים.

כיום, ישנן שתי שיטות לרכישת פיברובלסטים ראשוניים: עיכול אנזימים ותרבית צמחים. עם זאת, זוהו מספר מכשולים להשגת פיברובלסטים ראשוניים, כגון הסיכון לזיהום על ידי חיידקים או פטריות שונים, ערבוב עם סוגים אחרים של תאים שאינם מוסרים בקלות, התקופה הארוכה של מחזור התרבית, השינויים הבאים במאפייני התא בהשוואה לתאים המקוריים, וכן הלאה⁹. לכן, פיתוח תהליך אפשרי ויעיל להשגת פיברובלסטים ראשוניים הוא הבסיס למחקרים ויישומים נוספים. מחקר זה מתאר פרוטוקול אופטימלי לחילוץ פיברובלסטים ראשוניים מרקמות קלואידיות שיכולים לספק פיברובלסטים טהורים ויציבים ביעילות ובהתמדה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת הסקירה המוסדית של בית החולים לדרמטולוגיה, האוניברסיטה הרפואית הדרומית (2020081). הסכמה מדעת של המטופל התקבלה לפני איסוף הרקמות.

1. הכנה

הערה: יש לבצע את ההליכים הבאים בסביבה סטרילית תחת ארון בטיחות ביולוגי.

1. הכינו מדיום תרבית שלם על ידי הוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין B תמיסת (PSA) לתמיסת Eagle medium (DMEM) בעלת גלוקוז גבוה של Dulbecco.
2. הכינו תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) עם PSA על ידי הוספת 1% PSA ל-1x PBS. הכן PBS עם FBS על ידי הוספת 1% FBS ל- 1x PBS.
3. הכינו מספר מספריים, מלקחיים ואזמלים מעוקרים על ידי אוטוקלאבינג.

2. השגת רקמות שהוסרו

1. להשיג רקמות מחולי קלואיד באמצעות ניתוח. אספו את רקמות הקלואיד הטריות בשקית אריזה סטרילית או בצינור צנטריפוגה סטרילי, והעבירו אותן לארון בטיחות ביולוגי במעבדה בהקדם האפשרי.
   הערה: בפרוטוקול זה, גודל הרקמה הקלואידית הנרכשת היה בערך ~ 20 x 20 x 10 מ"מ³, והגודל עשוי להשתנות בהתאם לניתוח.

3. בידוד

1. הוציאו את הרקמה הקלואידית באמצעות פינצטה סטרילית, והניחו אותה בצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל המכיל 10-25 מ"ל PBS עם 1% PSA למשך 10 דקות. לאחר מכן, להכין צלחת 6 בארות, ולהוסיף 4 מ"ל של PBS בתוספת 1% PSA לכל באר. הוציאו את הרקמה באמצעות פינצטה מעוקרת, ושטפו אותה פעמיים עם PBS בתוספת 1% PSA. באמצעות מלקחיים סטריליים, להעביר את הרקמה ברצף מבאר אחת לאחרת.
2. הסר את שכבות השומן והאפידרמיס באמצעות מספריים כירורגיים או אזמל כירורגי, והשאר את שכבת הדרמיס ללא נגיעה. חותכים ומנתחים את שכבת הדרמיס ל 3-5 מ"מ² חתיכות עם מספריים, מעבירים חתיכות אלה באמצעות מלקחיים סטריליים לבאר הבאה, ושוטפים אותם ב- PBS עם תמיסת PSA 1% שוב.

4. תרבות

1. מניחים את חתיכות רקמת הדרמיס בצלחות פטרי באמצעות מלקחיים מעוקרים; ודא שמספר החתיכות הוא בין 10 ל -30 והמרחק בין כל חתיכה הוא >5 מ"מ. הניחו את צלחות הפטרי הפוכות באינקובטור 5% CO₂ בטמפרטורה של 37°C למשך 30-60 דקות עד שחתיכות הרקמות מתייבשות מעט ונדבקות לצלחת הפטרי. לאחר מכן, להוסיף DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% PSA, בזהירות להניח את צלחות פטרי לתוך אינקובטור 5% CO₂ ב 37 ° C.
   הערה: פיברובלסטים הם אוכלוסיית תאים הטרוגנית מבחינה מורפולוגית ותפקודית. בהתחשב במורכבות זו, צעדי הבידוד והתרבות צריכים להתבצע בזהירות; בחר את חתיכות רקמת העור קלואיד באופן שווה, וערבב חתיכות אלה היטב לפני הנחתם בצלחת פטרי.
2. לאחר 3 ימים, החליפו מחצית מהסופרנאטנט במדיום תרבית שלם. שנה את מדיום התרבות כל 2-3 ימים. צפו בפיברובלסטים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 40 בכל יום.
   הערה: יש לבצע את כל השלבים בעדינות. אל תזיזו את צלחת הפטרי במשך יומיים לאחר הבידוד, מכיוון שלוקח זמן לחתיכות הרקמה להיצמד לצלחות הפטרי.
3. כאשר הפיברובלסטים הגדלים סביב חלקי הרקמה מגיעים לכ-90% התמזגות, הסר את פיסות הרקמה ואת מדיום התרבית. שטפו את הפיברובלסטים עם PBS 1x סטרילי, והוסיפו 2 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA סטרילית 1x לצלחות. לדגור על התאים במשך כ~ 3-5 דקות ב 37 ° C באינקובטור לח 5% CO₂ . טפחו בעדינות על צלחת התרבית, והתבוננו בה תחת מיקרוסקופ. כאשר רוב התאים מתנתקים מהצלחת, מוסיפים 2 מ"ל של מדיום שלם כדי לסיים את תהליך העיכול.
4. מעבירים את מתלה התא לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 15 מ"ל, וצנטריפוגות את הצינור בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט בזהירות, והשהו מחדש את כדורית התא בתווך מלא. זרעו את הפיברובלסטים בצלחת תרבית תאים בקוטר 9 ס"מ, ודגרו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח של 5%_CO2 .

5. תחזוקה ושימור

1. כעבור 3-4 ימים, כאשר הפיברובלסטים גדלו למפגש של 80%, חזרו על שלבים 4.2-4.4, ועברו את הפיברובלסטים ביחס של 1:3. השתמש בפיברובלסטים העוברים לניסויים נוספים.
   הערה: יש לעצור את תרבית הפיברובלסטים לאחר 10 מעברים, מכיוון שהתאים עשויים להתחיל להראות מאפיינים משתנים בהשוואה לתאים המקוריים.
2. Cryoלשמר את התאים העוברים של P1-P3 בחנקן נוזלי לשימוש נוסף.
   1. חזור על שלבים 4.2-4.3. מעבירים את מתלה התא לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 15 מ"ל, וצנטריפוגות את הצינור למשך 3 דקות ב-300 × גרם. השליכו את הסופרנאטנט בזהירות, השהו מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של מדיום הקפאת תאים המכיל 90% FBS ו-10% DMSO, והעבירו את התרחיף לצינוריות הקפאה של התא.
   2. העבירו את התאים לקופסה קפואה, ואז הכניסו את הקופסה הקפואה למקפיא בטמפרטורה של -80°C. לאחר יום אחד, להעביר את התאים לחנקן נוזלי לשימור לטווח ארוך.

6. זיהוי פיברובלסטים על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית

1. מניחים את הכיסויים העגולים בצלחת של 24 בארות, ומגדלים את הפיברובלסטים העוברים בריכוז של 1 × 10⁴ תאים/באר. כאשר הפיברובלסטים מגיעים למפגש של 60%, הסר את מדיום התרבית. הוסף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde כדי לקבע את הפיברובלסטים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולשטוף 3x עם PBS במשך 1 דקות בכל פעם.
   הערה: ספור את מספר התאים באמצעות שקופית המוציטומטר מתחת למיקרוסקופ או מונה תאים אוטומטי.
2. הסר את PBS, לדגור עם 0.5% Triton X-100 במשך 20 דקות עבור חדירה של קרום התא, ולאחר מכן לשטוף 3x עם PBS במשך 1 דקות בכל פעם. הוסיפו PBS עם אלבומין בסרום בקר 0.5% והשרו למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסר אותו, והוסף את נוגדן PDGFR-α/vimentin מדולל בנוגדנים ב 1:1,000. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).
3. למחרת, להסיר את הנוגדן הראשוני, לשטוף את התאים 3x עם PBS במשך 3 דקות, ולהוסיף את הנוגדן המשני Alexa Fluor-555 עז נגד ארנב IgG מדולל עם נוגדנים מדלל ב 1:200 כדי להשרות במשך 1 שעה.
4. הסר את הנוגדן המשני, ולשטוף את התאים 3x עם PBS. הוציאו את הכיסויים העגולים בעזרת מלקחיים, הניחו אותם על מגלשות זכוכית והוסיפו 50 μL של תמיסת 5 מיקרוגרם/מ"ל 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כדי להכתים את גרעיני התא. שמרו את הדגימות בקופסה רטובה וחשוכה, והתבוננו בהן תחת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי פלואורסצנטי.
   הערה: הוסף קבוצת ביקורת שלילית ללא נוגדן ראשוני אך עם נוגדן משני כדי לא לכלול כתמים לא ספציפיים.

7. זיהוי פיברובלסטים לפי ציטומטריית זרימה

1. אספו את גלולת התא לתוך צינור צנטריפוגה סטרילית של 1.5 מ"ל, והשהו מחדש עם 50 מיקרוליטר של PBS המכיל 1% FBS. יש לדגור עם anti-CD90 למשך 30 דקות בחושך, ולהוסיף בקרת איזוטיפ אנטי-IgG לקבוצת הביקורת. לאחר מכן, הוסף 200 μL של PBS המכיל 1% FBS, וצנטריפוגה את הצינור במשך 10 דקות ב 300 × גרם ב 4 ° C.
2. הסר את supernatant, ולהוסיף 200 μL של PBS המכיל 1% FBS. השהה מחדש וסנן את המתלה דרך מסננת תאים (70 רשת). הוסף תמיסת מלאי של 5 מיקרוגרם/מ"ל של DAPI בשעה 1:100 לתסנין, ולאחר מכן קבל את התוצאות באמצעות ציטומטריית זרימה. הגדר את הפיזור הקדמי (FSC) כאבסיסה ואת הפיזור הצדדי (SSC) כאורדינטה, והקף את אוכלוסיית התאים הראשית. בחר את אוכלוסיית התא, והגדר את phycoerythrin כמו abscissa ואת הספירה כמו הקואורדינטה לניתוח.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ציר הזמן של הפרוטוקול מסוכם באיור 1A. כמה תמונות מייצגות של תהליך הבידוד מוצגות באיור 2; שכבות האפידרמיס והשומן הוסרו בקפידה, ושכבת הדרמיס הופרדו לשברים קטנים של 3-4 מ"מ², שחוסנו לצלחות הפטרי.

כפי שניתן לראות באיור 3A, כמה ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

השגת פיברובלסטים ראשוניים מרקמות קלואידיות היא בסיס קריטי למחקר נוסף. עד כה, היו שתי שיטות לרכישת פיברובלסטים ראשוניים: עיכול אנזימים ותרבית צמחים^11,12,13,14. עם זאת, לשתי השיטות המסורתיות יש מגבלות, כגון רגישות לזיהום, ערב?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	CFT002015
15 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	8076
4% polyformaldehyde	Beyotime Biotechnology	P0099	Cell fixation
50 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	8081	Put keloid tissue
Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG	Abcam	Alexa Fluor 555	second antibody for immunofluorescence staining assay
Anti human CD90	BioLegend	B301002	Identify the purity of fibroblasts
Antibody diluent	Beyotime Biotechnology	P0262
Biological safety cabinet	Thermo Scientific	1300 series A2	Isolation and culture cells
Bovine serum albumin	aladdin	B265993	Blocking for immunofluorescence staining assay
Carbon dioxide incubator	ESCO	CCL-170B-8	Using for culturing cells
Cell cryotubes	Corning	43513	Store the cells in low temperature
centrifugal machine	Thermo Fisher	ST 16R	Discard supernatant
DAPI	Beyotime Biotechnology	C1006	Stain the cellular nucleus
DMSO	MP Biomedicals	196055	Using for preserving cells
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco	C11995500BT	Culture medium solution
Fetal bovine serum	BI	04-001-1A
Flow cytometer	BD	BD FACSCelesta	Observing the identity of cells
frozen box	Thermo Scientific	5100-0050
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2
Laser confocal microscope	Nikon	AIR-HD25	Observing the immunofluorescence staining assay
PDGFR-α antibody	CST	3174T	First antibody for immunofluorescence staining assay
Penicillin-streptomycin-Am solution	Solarbio	P1410	Add in culture medium solution to avoid contamination
petri dish	JETBIOFIL	7556	Culture fibroblasts
Phosphate buffered saline solution	Gibco	C10010500BT	Culture medium solution
Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)	Cell Signaling Technology	5742S	As a control for flow cytometry
Round coverslip	Biosharp	801007	Cell culture
Triton X 100	Solarbio	T8200	Punch holes in the cell membrane
Trypsin-EDTA	Gibco	25200072	Used for passaging cells
Vimentin antibody	Abcam	ab8978	First antibody for immunofluorescence staining assay