Isolamento, Cultura e Caracterização de Fibroblastos Dérmicos Primários de Tecido Queloide Humano

Resumo

Este estudo descreve um protocolo otimizado para o estabelecimento de fibroblastos primários a partir de tecidos queloides que podem fornecer de forma eficaz e constante fibroblastos puros e viáveis.

Resumo

Os fibroblastos, o principal tipo celular no tecido queloide, desempenham um papel essencial na formação e desenvolvimento dos queloides. O isolamento e a cultura de fibroblastos primários derivados de tecido queloide são a base para novos estudos da função biológica e dos mecanismos moleculares dos queloides, bem como novas estratégias terapêuticas para o seu tratamento. O método tradicional de obtenção de fibroblastos primários apresenta limitações, como mau estado celular, mistura com outros tipos de células e suscetibilidade à contaminação. Este trabalho descreve um protocolo otimizado e facilmente reprodutível que poderia reduzir a ocorrência de possíveis problemas na obtenção de fibroblastos. Neste protocolo, os fibroblastos podem ser observados 5 dias após o isolamento e atingem quase 80% de confluência após 10 dias de cultura. Em seguida, os fibroblastos são passados e verificados usando PDGFRα e anticorpos vimentina para ensaios de imunofluorescência e CD90 para citometria de fluxo. Em conclusão, fibroblastos de tecido queloide podem ser facilmente adquiridos através deste protocolo, o que pode fornecer uma fonte abundante e estável de células em laboratório para pesquisa de queloide.

Introdução

O queloide, doença fibroproliferativa, manifesta-se como o crescimento contínuo de placas que frequentemente invadem a pele normal circundante sem autolimitação e causam vários graus de prurido, dor e cargas estéticas e psicológicas para os pacientes¹. Os fibroblastos, células primárias envolvidas nos queloides, desempenham papel essencial na formação e desenvolvimento dessa doença por proliferação excessiva, produção redundante de matriz extracelular e desorganização de colágenos ^2,3. No entanto, a patogênese subjacente permanece obscura, e um método terapêutico eficaz para queloide ainda está faltando; portanto, há uma necessidade urgente de novas pesquisas ^4,5.

Como não existe um modelo animal ideal para a pesquisa de queloide in ^vivo6,7, a construção de um modelo in vitro por meio da aquisição de fibroblastos primários de tecidos queloides pode oferecer viabilidade e confiabilidade para a pesquisa de queloide ^2,6. As células primárias são aquelas derivadas diretamente do tecido vivo, e é geralmente reconhecido que essas células podem se assemelhar mais ao estado fisiológico e ao background genético de múltiplos indivíduos em comparação com linhagens celulares ^8,9. A cultura de células primárias fornece um meio poderoso para estudar o crescimento e o metabolismo das células, bem como outros fenótipos celulares.

Atualmente, existem dois métodos para aquisição de fibroblastos primários: digestão enzimática e cultura de explantes. Entretanto, vários obstáculos têm sido identificados para a obtenção de fibroblastos primários, tais como o risco de contaminação por várias bactérias ou fungos, a mistura com outros tipos de células que não são facilmente removidas, o longo período do ciclo de cultura, as subsequentes mudanças nas características celulares em relação às células originais, e assim por diante⁹. Portanto, o desenvolvimento de um processo viável e eficaz para a obtenção de fibroblastos primários é a base para novos estudos e aplicações. Este estudo descreve um protocolo otimizado para extração de fibroblastos primários de tecidos queloides que podem fornecer fibroblastos puros e viáveis de forma eficaz e constante.

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Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa do Hospital de Dermatologia da Southern Medical University (2020081). O consentimento informado dos pacientes foi obtido antes da coleta de tecidos dos indivíduos.

1. Preparo

NOTA: Os seguintes procedimentos devem ser realizados em um ambiente estéril sob um armário de segurança biológica.

1. Preparar o meio de cultura completo adicionando 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de solução de penicilina-estreptomicina-anfotericina B (PSA) ao meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com alto teor de glicose.
2. Preparar solução salina tamponada com fosfato (PBS) com PSA adicionando PSA a 1% em 1x PBS. Prepare o PBS com FBS adicionando 1% de FBS a 1x PBS.
3. Prepare várias tesouras, pinças e bisturis esterilizados por autoclavagem.

2. Obtenção de tecidos removidos

1. Obter tecidos de pacientes queloides através de cirurgia. Recolher os tecidos queloides frescos num saco de embalagem estéril ou tubo centrífugo estéril e transferi-los para um armário de segurança biológica no laboratório o mais rapidamente possível.
   OBS: Neste protocolo, o tamanho do tecido queloide adquirido foi de aproximadamente ~20 x 20 x 10^mm3, podendo variar dependendo da cirurgia.

3. Isolamento

1. Retire o tecido queloide usando uma pinça estéril e coloque-o em um tubo de centrífuga estéril de 50 mL contendo 10-25 mL de PBS com PSA 1% por 10 min. Em seguida, prepare uma placa de 6 poços e adicione 4 mL de PBS suplementado com PSA a 1% em cada poço. Retire o tecido usando uma pinça esterilizada e lave-o duas vezes com PBS suplementado com PSA a 1%. Usando pinças estéreis, transfira o tecido sequencialmente de um poço para outro.
2. Remova as camadas adiposas e epidérmicas usando uma tesoura cirúrgica ou um bisturi cirúrgico e deixe a camada da derme intocada. Apague e disseque a camada da derme em^{3-5 mm 2} pedaços com tesoura, transfira essas peças usando pinça estéril para o próximo poço e lave-as em PBS com solução de PSA a 1% novamente.

4. Cultura

1. Colocar os pedaços de tecido da derme em placas de Petri usando pinça esterilizada; Certifique-se de que o número de peças esteja entre 10 e 30 e que a distância entre cada peça seja de >5 mm. Coloque as placas de Petri de cabeça para baixo em uma incubadora de 5% CO₂ a 37 °C por 30-60 min até que os pedaços de tecidos sequem um pouco e grude na placa de Petri. Em seguida, adicione DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de PSA e coloque cuidadosamente as placas de Petri em uma incubadora de 5% de CO₂ a 37 °C.
   NOTA: Os fibroblastos são uma população celular morfológica e funcionalmente heterogênea. Considerando essa complexidade, as etapas de isolamento e cultura devem ser realizadas com cuidado; Selecione os pedaços de tecido dérmico queloide uniformemente e misture bem esses pedaços antes de colocá-los na placa de Petri.
2. Após 3 dias, substituir metade do sobrenadante por um meio de cultura completo. Troque o meio de cultura a cada 2-3 dias. Observar os fibroblastos ao microscópio com aumento de 40x todos os dias.
   NOTA: Todas as etapas devem ser executadas com delicadeza. Não mova a placa de Petri por 2 dias após o isolamento, pois os pedaços de tecido levam tempo para aderir às placas de Petri.
3. Quando os fibroblastos que crescem ao redor dos pedaços de tecido atingirem aproximadamente 90% de confluência, remova os pedaços de tecido e o meio de cultura. Lave os fibroblastos com 1x PBS estéril e adicione 2 mL de solução estéril de tripsina-EDTA 1x às placas. Incubar as células por aproximadamente ~3-5 min a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO₂ . Bata suavemente no prato de cultura e observe-o ao microscópio. Quando a maioria das células se desprender da placa, adicione 2 mL de meio completo para finalizar o processo de digestão.
4. Transferir a suspensão celular para um tubo de centrífuga estéril de 15 mL e centrifugar o tubo a 300 × g por 3 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante com cuidado e ressuspenda o pellet celular em meio completo. Semeando os fibroblastos em uma placa de cultura celular de 9 cm e incubar a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO₂ .

5. Manutenção e preservação

1. Aproximadamente 3-4 dias depois, quando os fibroblastos tiverem crescido até 80% de confluência, repita os passos 4,2-4,4 e passe pelos fibroblastos na proporção de 1:3. Use os fibroblastos passados para experimentos posteriores.
   NOTA: A cultura de fibroblastos deve ser interrompida após 10 passagens, pois as células podem começar a apresentar características alteradas em relação às células originais.
2. Criopreservar as células passadas de P1-P3 em nitrogênio líquido para uso posterior.
   1. Repita as etapas 4.2-4.3. Transfira a suspensão celular para um tubo centrífugo estéril de 15 mL e centrifugar o tubo por 3 min a 300 × g. Descarte o sobrenadante cuidadosamente, ressuspenda o pellet de células em 1 mL de meio de congelamento celular contendo 90% de FBS e 10% de DMSO e transfira a suspensão para criotubos celulares.
   2. Mova as células para uma caixa congelada e, em seguida, coloque a caixa congelada em um freezer de -80 °C. Após 1 dia, transferir as células para nitrogênio líquido para preservação a longo prazo.

6. Identificação de fibroblastos pela coloração de imunofluorescência

1. Coloque as lamínulas redondas em uma placa de 24 poços e cultive os fibroblastos passados em uma concentração de 1 × 10⁴ células/poço. Quando os fibroblastos atingirem 60% de confluência, retirar o meio de cultura. Adicionar 1 mL de paraformaldeído a 4% para fixar os fibroblastos por 20 min à temperatura ambiente e lavar 3x com PBS por 1 min de cada vez.
   NOTA: Conte o número de células usando uma lâmina de hemocitômetro sob um microscópio ou um contador automático de células.
2. Retire o PBS, incube com Triton X-100 a 0,5% por 20 min para a permeabilização das membranas celulares e, em seguida, lave 3x com PBS por 1 min de cada vez. Adicionar PBS com albumina de soro bovino a 0,5% e deixar de molho por 30 min. Em seguida, retire-o e adicione o anticorpo PDGFR-α/vimentina diluído em diluente de anticorpos a 1:1.000. Incubar durante a noite a 4 °C.
3. No dia seguinte, remova o anticorpo primário, lave as células 3x com PBS por 3 min e adicione o anticorpo secundário Alexa Fluor-555 cabra anti-coelho IgG diluído com diluente de anticorpos a 1:200 para deixar de molho por 1 h.
4. Remova o anticorpo secundário e lave as células 3x com PBS. Retire as lamínulas redondas com pinças, coloque-as em lâminas de vidro e adicione 50 μL de 5 μg/mL de solução de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para corar os núcleos celulares. Mantenha as amostras em uma caixa escura e úmida e observe-as sob um microscópio confocal de fluorescência a laser.
   NOTA: Adicione um grupo de controlo negativo sem um anticorpo primário, mas com um anticorpo secundário para excluir a coloração inespecífica.

7. Identificação de fibroblastos por citometria de fluxo

1. Coletar o pellet de células em um tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL e ressuspender com 50 μL de PBS contendo FBS a 1%. Incubar com anti-CD90 por 30 min no escuro e adicionar um controle de isotipo anti-IgG ao grupo controle. Em seguida, adicionar 200 μL de PBS contendo FBS a 1% e centrifugar o tubo por 10 min a 300 × g a 4 °C.
2. Retire o sobrenadante e adicione 200 μL de PBS contendo 1% de SFB. Ressuspenda e filtre a suspensão através de um filtro de células (70 mesh). Adicionar uma solução-mãe de 5 μg/mL de DAPI a 1:100 ao filtrado e, em seguida, obter os resultados por citometria de fluxo. Defina a dispersão direta (FSC) como a abscissa e a dispersão lateral (SSC) como a ordenada, e circule a população celular principal. Selecione a população celular e defina a ficoeritrina como a abscissa e a contagem como a ordenada para análise.

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Resultados

A linha do tempo do protocolo está resumida na Figura 1A. Algumas imagens representativas do processo de isolamento são mostradas na Figura 2; a epiderme e as camadas adiposas foram cuidadosamente removidas, e a camada da derme foi separada em pequenos fragmentos de 3-4 mm², que foram inoculados nas placas de Petri.

Como mostrado na Figura 3A, vários crescimentos de fibroblastos dos peda...

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Discussão

A obtenção de fibroblastos primários a partir de tecidos queloides é uma base crítica para futuras pesquisas. Até o momento, existem dois métodos para aquisição de fibroblastos primários: digestão enzimática e cultura de explantes11,12,13,14. Entretanto, ambos os métodos tradicionais apresentam limitações, como suscetibilidade à contaminação, mistura com outros tipos de célul...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	CFT002015
15 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	8076
4% polyformaldehyde	Beyotime Biotechnology	P0099	Cell fixation
50 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	8081	Put keloid tissue
Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG	Abcam	Alexa Fluor 555	second antibody for immunofluorescence staining assay
Anti human CD90	BioLegend	B301002	Identify the purity of fibroblasts
Antibody diluent	Beyotime Biotechnology	P0262
Biological safety cabinet	Thermo Scientific	1300 series A2	Isolation and culture cells
Bovine serum albumin	aladdin	B265993	Blocking for immunofluorescence staining assay
Carbon dioxide incubator	ESCO	CCL-170B-8	Using for culturing cells
Cell cryotubes	Corning	43513	Store the cells in low temperature
centrifugal machine	Thermo Fisher	ST 16R	Discard supernatant
DAPI	Beyotime Biotechnology	C1006	Stain the cellular nucleus
DMSO	MP Biomedicals	196055	Using for preserving cells
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco	C11995500BT	Culture medium solution
Fetal bovine serum	BI	04-001-1A
Flow cytometer	BD	BD FACSCelesta	Observing the identity of cells
frozen box	Thermo Scientific	5100-0050
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2
Laser confocal microscope	Nikon	AIR-HD25	Observing the immunofluorescence staining assay
PDGFR-α antibody	CST	3174T	First antibody for immunofluorescence staining assay
Penicillin-streptomycin-Am solution	Solarbio	P1410	Add in culture medium solution to avoid contamination
petri dish	JETBIOFIL	7556	Culture fibroblasts
Phosphate buffered saline solution	Gibco	C10010500BT	Culture medium solution
Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)	Cell Signaling Technology	5742S	As a control for flow cytometry
Round coverslip	Biosharp	801007	Cell culture
Triton X 100	Solarbio	T8200	Punch holes in the cell membrane
Trypsin-EDTA	Gibco	25200072	Used for passaging cells
Vimentin antibody	Abcam	ab8978	First antibody for immunofluorescence staining assay