人瘢痕疙瘩组织中原代真皮成纤维细胞的分离、培养和表征

摘要

本研究描述了一种优化的方案，用于从瘢痕疙瘩组织中建立原代成纤维细胞，可以有效和稳定地提供纯净和可行的成纤维细胞。

摘要

成纤维细胞是瘢痕疙瘩组织中的主要细胞类型，在瘢痕疙瘩的形成和发展中起着至关重要的作用。来自瘢痕疙瘩组织的原代成纤维细胞的分离和培养是进一步研究瘢痕疙瘩的生物学功能和分子机制以及治疗瘢痕疙瘩的新治疗策略的基础。获得原代成纤维细胞的传统方法具有局限性，例如细胞状态差，与其他类型的细胞混合以及易受污染。本文描述了一种优化且易于重现的方案，可以减少获取成纤维细胞时可能出现问题的发生。在该方案中，可以在分离后5天观察到成纤维细胞，并在培养10天后达到近80%的汇合度。然后，使用用于免疫荧光测定的PDGFRα和vimentin抗体以及用于流式细胞术的CD90抗体传代和验证成纤维细胞。总之，通过该方案可以轻松获得来自瘢痕疙瘩组织的成纤维细胞，这可以为瘢痕疙瘩研究提供实验室中丰富而稳定的细胞来源。

引言

瘢痕疙瘩是一种纤维增殖性疾病，表现为斑块的持续生长，这些斑块经常侵入周围的正常皮肤而没有自限性，并引起患者不同程度的瘙痒、疼痛以及美容和心理负担¹.成纤维细胞是参与瘢痕疙瘩的原代细胞，通过过度增殖、多余的细胞外基质产生和无序的胶原蛋白在这种疾病的形成和发展中起着至关重要的作用^2,3。然而，潜在的发病机制尚不清楚，仍然缺乏有效的瘢痕疙瘩治疗方法;因此，迫切需要进一步研究^4,5。

由于体内瘢痕疙瘩研究没有理想的动物模型^6,7，通过从瘢痕疙瘩组织中获取原代成纤维细胞来构建体外模型可以为瘢痕疙瘩研究提供可行性和可靠性^2,6。原代细胞是直接来源于活组织的细胞，人们普遍认为，与细胞系^8,9相比^，这些细胞可以更接近多个个体的生理状态和遗传背景。原代细胞培养为研究细胞的生长和代谢以及其他细胞表型提供了一种强有力的手段。

目前，获得原代成纤维细胞的方法有两种:酶消化和外植体培养。然而，已经确定了获得原代成纤维细胞的几个障碍，例如被各种细菌或真菌污染的风险，与不易去除的其他类型的细胞混合，培养周期的长周期，与原始细胞相比细胞特性的后续变化，^等等9.因此，开发一种可行且有效的方法来获得原代成纤维细胞是进一步研究和应用的基础。本研究描述了一种优化的方案，用于从瘢痕疙瘩组织中提取原代成纤维细胞，可以有效和稳定地提供纯净和可行的成纤维细胞。

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研究方案

这项研究得到了南方医科大学皮肤病医院机构审查委员会的批准（2020081）。在从个体收集组织之前，已获得知情的患者同意。

1. 准备

注意:以下程序应在生物安全柜下的无菌环境中进行。

1. 通过将 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素-链霉素-两性霉素 B 溶液 （PSA） 添加到高葡萄糖 Dulbecco 的改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中来制备完整的培养基。
2. 通过将 1% PSA 添加到 1x PBS 中来制备含有 PSA 的磷酸盐缓冲盐溶液 （PBS）。通过将 1% FBS 添加到 1x PBS 中来制备带有 FBS 的 PBS。
3. 通过高压灭菌准备几把消毒的剪刀、镊子和手术刀。

2. 获取取出的组织

1. 通过手术从瘢痕疙瘩患者身上获取组织。将新鲜的瘢痕疙瘩组织收集在无菌包装袋或无菌离心管中，并尽快将其转移到实验室的生物安全柜中。
   注意:在此协议中，获得的瘢痕疙瘩组织的大小约为~20 x 20 x 10 mm³，并且大小可能因手术而异。

3. 隔离

1. 使用无菌镊子取出瘢痕疙瘩组织，并将其放入含有10-25mL PBS和1%PSA的50mL无菌离心管中10分钟。然后，准备一个 6 孔板，并向每个孔中加入 4 mL 补充有 1% PSA 的 PBS。使用无菌镊子取出纸巾，并用补充有1%PSA的PBS清洗两次。使用无菌镊子，将组织从一个孔依次转移到下一个孔。
2. 使用手术剪刀或手术刀去除脂肪和表皮层，并保持真皮层不变。用剪刀将真皮层修剪并解剖成3-5mm² 块，使用无菌镊子将这些碎片转移到下一个孔中，然后再次用1%PSA溶液在PBS中洗涤。

4. 文化

1. 使用灭菌的镊子将真皮组织片放入培养皿中;确保件数在 10 到 30 之间，每件之间的距离为 >5 毫米。将培养皿倒置在37°C的5%CO₂ 培养箱中30-60分钟，直到组织片稍微干燥并粘附在培养皿上。然后，加入补充有10%FBS和1%PSA的DMEM，并小心地将培养皿放入37°C的5%CO₂ 培养箱中。
   注意:成纤维细胞是形态和功能异质的细胞群。考虑到这种复杂性，应谨慎执行分离和培养步骤;均匀地选择瘢痕疙瘩真皮组织碎片，并在将它们放入培养皿之前将这些碎片充分混合。
2. 3天后，用完全培养基替换一半的上清液。每2-3天更换一次培养基。每天在显微镜下以40倍放大倍率观察成纤维细胞。
   注意:所有步骤都应轻柔地执行。隔离后2天内不要移动培养皿，因为组织碎片需要时间才能粘附在培养皿上。
3. 当组织碎片周围生长的成纤维细胞达到约90%汇合度时，去除组织碎片和培养基。用无菌 1x PBS 洗涤成纤维细胞，并向平板中加入 2 mL 无菌 1x 胰蛋白酶-EDTA 溶液。将细胞在37°C下在加湿的5%CO₂ 培养箱中孵育约~3-5分钟。轻轻敲击培养皿，然后在显微镜下观察。当大多数细胞从平板上分离时，加入 2 mL 完全培养基以结束消化过程。
4. 将细胞悬液转移到15mL无菌离心管中，并在室温下以300× g 离心管3分钟。小心丢弃上清液，并将细胞沉淀重悬于完全培养基中。将成纤维细胞接种到9cm细胞培养皿中，并在37°C下在加湿的5%CO₂ 培养箱中孵育。

5. 维护和保存

1. 大约3-4天后，当成纤维细胞生长到80%汇合时，重复步骤4.2-4.4，并以1:3的比例传代成纤维细胞。使用传代的成纤维细胞进行进一步实验。
   注意:成纤维细胞培养应在10代后停止，因为与原始细胞相比，细胞可能会开始显示出改变的特征。
2. 将P1-P3的传代细胞冷冻保存在液氮中以备进一步使用。
   1. 重复步骤 4.2-4.3。将细胞悬液转移到15mL无菌离心管中，并以300× g离心管3分钟。小心弃去上清液，将细胞沉淀重悬于含有90%FBS和10%DMSO的1mL细胞冷冻培养基中，并将悬浮液转移到细胞冷冻管中。
   2. 将细胞移动到冷冻盒中，然后将冷冻盒放入-80°C冰箱中。1天后，将细胞转移到液氮中长期保存。

6. 免疫荧光染色鉴定成纤维细胞

1. 将圆形盖玻片置于24孔板中，并以1×10⁴ 细胞/孔的浓度培养传代的成纤维细胞。当成纤维细胞达到60%汇合时，除去培养基。加入 1 mL 4% 多聚甲醛以在室温下固定成纤维细胞 20 分钟，并用 PBS 洗涤 3 次，每次 1 分钟。
   注意:在显微镜下使用血细胞计数器载玻片或自动细胞计数器计数细胞数。
2. 取出PBS，用0.5%Triton X-100孵育20分钟以透化细胞膜，然后每次用PBS洗涤3次1分钟。加入PBS和0.5%牛血清白蛋白，浸泡30分钟。然后，将其取出，并加入在抗体稀释剂中以1:1,000稀释的PDGFR-α/vimentin抗体。在4°C孵育过夜。
3. 第二天，除去一抗，用PBS洗涤细胞3倍3分钟，加入二抗Alexa Fluor-555山羊抗兔IgG以1:200稀释抗体稀释剂浸泡1h。
4. 去除二抗，并用PBS洗涤细胞3次。使用镊子取出圆形盖玻片，将它们放在载玻片上，然后加入 50 μL 5 μg/mL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 溶液以染色细胞核。将样品保存在潮湿的暗盒中，并在激光共聚焦荧光显微镜下观察它们。
   注意:添加不含一抗但有二抗的阴性对照组以排除非特异性染色。

7. 流式细胞术鉴定成纤维细胞

1. 将细胞沉淀收集到 1.5 mL 无菌离心管中，并用含有 1% FBS 的 50 μL PBS 重悬。在黑暗中与抗CD90孵育30分钟，并向对照组添加抗IgG同种型对照。然后，加入含有1%FBS的200μLPBS，并在4°C下以300× g 离心管10分钟。
2. 除去上清液，加入 200 μL 含有 1% FBS 的 PBS。通过细胞过滤器（70目）重悬并过滤悬浮液。向滤液中加入 5 μg/mL 的 DAPI 储备溶液，以 1:100 的比例，然后通过流式细胞术获取结果。将前向散射 （FSC） 设置为横坐标，将侧散射 （SSC） 设置为纵坐标，并圈出主细胞群。选择细胞群，并将藻红蛋白设置为横坐标，将计数设置为纵坐标进行分析。

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结果

该协议的时间线总结在 图1A中。分离过程的一些代表性图像如图 2所示;小心地去除表皮和脂肪层，并将真皮层分离成3-4mm²的小碎片，接种到培养皿中。

如图3A所示，在处理后5天在显微镜下观察到组织碎片的几个成纤维细胞生长。如图3B所示，成纤维细胞显示出高增殖速率，并...

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讨论

从瘢痕疙瘩组织获得原代成纤维细胞是进一步研究的关键基础。到目前为止，有两种方法可以获得原代成纤维细胞:酶消化和外植体培养^11,12,13,14。然而，两种传统方法都有局限性，例如易受污染，与其他类型的细胞混合，培养期长，成功率低^15,16。这项研究...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	CFT002015
15 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	8076
4% polyformaldehyde	Beyotime Biotechnology	P0099	Cell fixation
50 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	8081	Put keloid tissue
Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG	Abcam	Alexa Fluor 555	second antibody for immunofluorescence staining assay
Anti human CD90	BioLegend	B301002	Identify the purity of fibroblasts
Antibody diluent	Beyotime Biotechnology	P0262
Biological safety cabinet	Thermo Scientific	1300 series A2	Isolation and culture cells
Bovine serum albumin	aladdin	B265993	Blocking for immunofluorescence staining assay
Carbon dioxide incubator	ESCO	CCL-170B-8	Using for culturing cells
Cell cryotubes	Corning	43513	Store the cells in low temperature
centrifugal machine	Thermo Fisher	ST 16R	Discard supernatant
DAPI	Beyotime Biotechnology	C1006	Stain the cellular nucleus
DMSO	MP Biomedicals	196055	Using for preserving cells
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco	C11995500BT	Culture medium solution
Fetal bovine serum	BI	04-001-1A
Flow cytometer	BD	BD FACSCelesta	Observing the identity of cells
frozen box	Thermo Scientific	5100-0050
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2
Laser confocal microscope	Nikon	AIR-HD25	Observing the immunofluorescence staining assay
PDGFR-α antibody	CST	3174T	First antibody for immunofluorescence staining assay
Penicillin-streptomycin-Am solution	Solarbio	P1410	Add in culture medium solution to avoid contamination
petri dish	JETBIOFIL	7556	Culture fibroblasts
Phosphate buffered saline solution	Gibco	C10010500BT	Culture medium solution
Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)	Cell Signaling Technology	5742S	As a control for flow cytometry
Round coverslip	Biosharp	801007	Cell culture
Triton X 100	Solarbio	T8200	Punch holes in the cell membrane
Trypsin-EDTA	Gibco	25200072	Used for passaging cells
Vimentin antibody	Abcam	ab8978	First antibody for immunofluorescence staining assay