인간 켈로이드 조직에서 일차 진피 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

요약

이 연구는 순수하고 실행 가능한 섬유아세포를 효과적이고 안정적으로 제공할 수 있는 켈로이드 조직으로부터 1차 섬유아세포를 확립하기 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다.

초록

켈로이드 조직의 주요 세포 유형인 섬유아세포는 켈로이드의 형성과 발달에 필수적인 역할을 합니다. 켈로이드 조직에서 유래한 일차 섬유아세포의 분리 및 배양은 켈로이드의 생물학적 기능 및 분자 메커니즘에 대한 추가 연구와 이를 치료하기 위한 새로운 치료 전략의 기초입니다. 1차 섬유아세포를 얻는 전통적인 방법은 열악한 세포 상태, 다른 유형의 세포와의 혼합 및 오염에 대한 감수성과 같은 한계가 있습니다. 이 논문은 섬유아세포를 얻을 때 발생할 수 있는 문제의 발생을 줄일 수 있는 최적화되고 쉽게 재현 가능한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜에서 섬유아세포는 분리 후 5일 후에 관찰할 수 있으며 배양 10일 후에 거의 80% 밀도에 도달할 수 있습니다. 이어서, 면역형광 분석을 위한 PDGFRα 및 비멘틴 항체 및 유세포 분석을 위한 CD90 항체를 사용하여 섬유아세포를 계대배양하고 검증한다. 결론적으로, 켈로이드 조직의 섬유아세포는 이 프로토콜을 통해 쉽게 얻을 수 있으며, 이는 켈로이드 연구를 위한 실험실에서 풍부하고 안정적인 세포 공급원을 제공할 수 있습니다.

서문

섬유증식성 질환인 켈로이드는 플라크가 지속적으로 증식하여 자가제한 없이 정상 피부 주변을 침범하는 경우가 많으며, 환자에게 다양한 정도의 가려움증, 통증, 미용적, 심리적 부담을 유발한다¹. 켈로이드에 관여하는 일차 세포인 섬유아세포는 과도한 증식, 중복 세포외 기질 생성, 무질서한 콜라겐을 통해 이 질병의 형성과 발달에 필수적인 역할을 합니다 ^2,3. 그러나 근본적인 발병기전은 아직 불분명하며 켈로이드에 대한 효과적인 치료 방법은 여전히 부족합니다. 따라서 추가 연구가 시급히 필요합니다 ^4,5.

생체 내 켈로이드 연구를 위한 이상적인 동물 모델이 없기 때문에 ^6,7, 켈로이드 조직에서 1차 섬유아세포를 획득하여 시험관 내 모델을 구축하면 켈로이드 연구 ^2,6에 대한 타당성과 신뢰성을 제공할 수 있습니다. 일차 세포는 살아있는 조직에서 직접 유래한 세포이며, 이러한 세포는 세포주와 비교하여 여러 개체의 생리적 상태 및 유전적 배경과 더 유사할 수 있다는 것이 일반적으로 인식되고 있다 ^8,9. 일차 세포 배양은 세포의 성장과 대사뿐만 아니라 다른 세포 표현형을 연구하는 강력한 수단을 제공합니다.

현재, 1차 섬유아세포를 획득하는 두 가지 방법이 있다: 효소 소화 및 체외이식편 배양. 그러나, 다양한 박테리아 또는 곰팡이에 의한 오염의 위험성 , 쉽게 제거되지 않는 다른 유형의 세포와의 혼합, 배양 주기의 긴 기간, 원래 세포와 비교하여 세포 특성의 후속 변화 등과 같은 일차 섬유아세포를 얻는 데 몇 가지 장애물이 확인되었습니다⁹. 따라서 1차 섬유아세포를 얻기 위한 실현 가능하고 효과적인 공정을 개발하는 것이 추가 연구 및 적용을 위한 기초입니다. 이 연구는 순수하고 실행 가능한 섬유아세포를 효과적이고 안정적으로 제공할 수 있는 켈로이드 조직에서 일차 섬유아세포를 추출하기 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다.

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프로토콜

이 연구는 Southern Medical University(2020081)의 Dermatology Hospital의 기관 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 개인으로부터 조직을 수집하기 전에 정보에 입각한 환자 동의를 얻었습니다.

1. 준비

알림: 다음 절차는 생물학적 안전 캐비닛 아래의 무균 환경에서 수행해야 합니다.

1. 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B 용액(PSA)을 고혈당 Dulbecco's modified Eagle 배지(DMEM)에 첨가하여 완전한 배양 배지를 준비합니다.
2. 1x PBS에 1% PSA를 첨가하여 PSA로 인산염 완충 식염수(PBS)를 준비합니다. 1x PBS에 1% FBS를 추가하여 FBS로 PBS를 준비합니다.
3. 고압 증기 멸균으로 멸균 된 가위, 집게 및 메스를 여러 개 준비하십시오.

2. 제거된 조직 얻기

1. 수술을 통해 켈로이드 환자로부터 조직을 얻습니다. 멸균 포장 백 또는 멸균 원심 분리기 튜브에 신선한 켈로이드 조직을 수집하고 가능한 한 빨리 실험실의 생물학적 안전 캐비닛으로 옮깁니다.
   참고: 이 프로토콜에서 획득한 켈로이드 조직의 크기는 약 ~20 x 20 x 10mm3이며 크기는 수술에 따라 다를 수 있습니다.

3. 격리

1. 멸균 핀셋을 사용하여 켈로이드 조직을 꺼내 1% PSA가 함유된 PBS 10-25mL가 들어 있는 50mL 멸균 원심분리기 튜브에 10분 동안 넣습니다. 그런 다음 6-웰 플레이트를 준비하고 1% PSA가 보충된 PBS 4mL를 각 웰에 추가합니다. 멸균 된 핀셋을 사용하여 티슈를 꺼내고 1 % PSA가 보충 된 PBS로 두 번 씻으십시오. 멸균 집게를 사용하여 조직을 한 우물에서 다음 우물로 순차적으로 옮깁니다.
2. 수술용 가위나 수술용 메스를 사용하여 지방층과 표피층을 제거하고 진피층은 그대로 둡니다. 진피층을 가위로 3-5mm² 개로 다듬고 해부한 후 멸균 집게를 사용하여 이 조각을 다음 우물로 옮기고 PBS에서 1% PSA 용액으로 다시 세척합니다.

4. 문화

1. 멸균 된 집게를 사용하여 페트리 접시에 진피 조직 조각을 놓습니다. 조각 수가 10에서 30 사이이고 각 조각 사이의 거리가 >5mm인지 확인하십시오. 페트리 접시를 5 ° C의 2 %_CO2 인큐베이터에 37-30 분 동안 거꾸로 놓고 조직 조각이 약간 마르고 페트리 접시에 달라 붙을 때까지 놓습니다. 이어서, 10% FBS 및 1% PSA로 보충된 DMEM을 첨가하고, 페트리 접시를 37°C에서 5%_CO2 인큐베이터에 조심스럽게 넣는다.
   참고: 섬유아세포는 형태학적으로나 기능적으로 이질적인 세포 집단입니다. 이러한 복잡성을 고려하여 분리 및 배양 단계는 주의해서 수행해야 합니다. 켈로이드 진피 조직 조각을 고르게 선택하고 이 조각을 잘 섞은 후 페트리 접시에 넣습니다.
2. 3 일 후, 상청액의 절반을 완전한 배양 배지로 교체하십시오. 2-3 일마다 배양 배지를 교체하십시오. 매일 40x 배율로 현미경으로 섬유아세포를 관찰합니다.
   알림: 모든 단계는 부드럽게 수행해야 합니다. 티슈 조각이 페트리 접시에 달라붙는 데 시간이 걸리므로 분리 후 2일 동안은 페트리 접시를 움직이지 마십시오.
3. 조직 조각 주위에서 자라는 섬유아세포가 대략 90% 밀도에 도달하면, 조직 조각 및 배양 배지를 제거한다. 멸균 1x PBS로 섬유아세포를 세척하고 멸균 1x 트립신-EDTA 용액 2mL를 플레이트에 추가합니다. 가습된 5%_CO2 인큐베이터에서 37°C에서 약 ~3-5분 동안 세포를 배양합니다. 배양 접시를 가볍게 두드리고 현미경으로 관찰합니다. 대부분의 세포가 플레이트에서 분리되면 2mL의 완전 배지를 추가하여 소화 과정을 종료합니다.
4. 세포 현탁액을 15mL 멸균 원심분리 튜브로 옮기고, 튜브를 실온에서 3분 동안 300× g 에서 원심분리한다. 상청액을 조심스럽게 버리고 세포 펠릿을 완전한 배지에 재현탁합니다. 섬유아세포를 9 cm 세포 배양 접시에 시딩하고, 가습된 5%_CO2 배양기에서 37°C에서 배양한다.

5. 유지 및 보존

1. 약 3-4일 후, 섬유아세포가 80% 밀도로 성장하면 4.2-4.4단계를 반복하고 섬유아세포를 1:3의 비율로 계대시킵니다. 추가 실험을 위해 계대배양된 섬유아세포를 사용하십시오.
   참고: 섬유아세포 배양은 세포가 원래 세포에 비해 변화된 특성을 보이기 시작할 수 있으므로 10 계대 후에 중단해야 합니다.
2. 추가 사용을 위해 P1-P3의 계대배양 세포를 액체 질소에 냉동 보존합니다.
   1. 4.2-4.3단계를 반복합니다. 세포 현탁액을 15 mL 멸균 원심분리 튜브로 옮기고, 튜브를 300 × g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 조심스럽게 버리고 90% FBS와 10% DMSO를 함유한 세포 동결 배지 1mL에 세포 펠릿을 재현탁하고 현탁액을 세포 극저온 튜브로 옮깁니다.
   2. 세포를 냉동 상자로 옮긴 다음 냉동 상자를 -80°C 냉동고에 넣습니다. 1 일 후, 장기 보존을 위해 세포를 액체 질소로 옮깁니다.

6. 면역형광염색에 의한 섬유아세포 동정

1. 둥근 커버슬립을 24웰 플레이트에 넣고 계대배양된 섬유아세포를 1 ×^{10 4} 세포/웰의 농도로 배양합니다. 섬유아세포가 60% 밀도에 도달하면 배양 배지를 제거합니다. 4% 파라포름알데히드 1mL를 넣어 섬유아세포를 실온에서 20분간 고정시킨 후 PBS로 매번 1분간 3회 세척한다.
   알림: 현미경 또는 자동 세포 계수기에서 혈구계 슬라이드를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
2. PBS를 제거하고, 세포막의 투과화를 위해 0.5% Triton X-100과 함께 20분 동안 배양한 다음, 매번 PBS로 1분 동안 3x 세척하였다. PBS에 0.5% 소 혈청 알부민을 넣고 30분 동안 담가둡니다. 그런 다음 제거하고 항체 희석액에 희석한 PDGFR-α/vimentin 항체를 1:1,000으로 첨가합니다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
3. 다음날, 1차 항체를 제거하고, 세포를 PBS로 3분 동안 3x 세척하고, 항체 희석제로 희석한 2차 항체 Alexa Fluor-555 염소 항-토끼 IgG를 1:200에서 1시간 동안 담가두었다.
4. 2차 항체를 제거하고, 세포를 PBS로 3x 세척하였다. 집게를 사용하여 둥근 커버슬립을 꺼내 유리 슬라이드에 놓고 5μg/mL 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 용액 50μL를 추가하여 세포핵을 염색합니다. 샘플을 젖은 어두운 상자에 보관하고 레이저 컨포칼 형광 현미경으로 관찰합니다.
   참고: 1차 항체는 없지만 2차 항체가 있는 음성 대조군을 추가하여 비특이적 염색을 배제합니다.

7. 유세포 분석에 의한 섬유아세포 동정

1. 세포 펠릿을 1.5mL 멸균 원심분리기 튜브에 수집하고 1% FBS가 포함된 PBS 50μL로 재현탁합니다. 암실에서 30분 동안 항-CD90과 함께 배양하고 항-IgG 이소타입 대조군을 대조군에 추가합니다. 이어서, 1% FBS를 함유하는 PBS 200 μL를 첨가하고, 튜브를 4°C에서 300 × g 에서 10분 동안 원심분리한다.
2. 상청액을 제거하고, 1% FBS를 함유하는 PBS 200 μL를 첨가한다. 현탁액을 다시 중단하고 셀 스트레이너(70메쉬)를 통해 여과합니다. 여과액에 1:100의 DAPI 원액 5μg/mL를 첨가한 후 유세포 분석으로 결과를 얻습니다. 전방 산란(FSC)을 가로축으로, 측면 산란(SSC)을 세로좌표로 설정하고 주 세포 집단에 원을 그립니다. 세포 집단을 선택하고 분석을 위해 phycoerythrin을 가로좌표로 설정하고 count를 세로좌표로 설정합니다.

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결과

프로토콜의 타임라인은 그림 1A에 요약되어 있습니다. 격리 프로세스의 일부 대표 이미지는 그림 2에 나와 있습니다. 표피층과 지방층을 조심스럽게 제거하고, 진피층을 3-4mm2의 작은 조각으로 분리하여 페트리 접시에 접종하였다.

도 3A에 나타낸 바와 같이, 조직 조각의 여러 섬유아세포 성장을 처?...

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토론

켈로이드 조직에서 일차 섬유아세포를 얻는 것은 추가 연구를 위한 중요한 기초입니다. 지금까지, 일차 섬유아세포를 획득하는 두 가지 방법이 있었다: 효소 소화 및 체외이식편 배양^11,12,13,14. 그러나 두 가지 전통적인 방법 모두 오염에 대한 민감성, 다른 유형의 세포와의 혼합, 긴 배양 기간 및 낮은...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	CFT002015
15 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	8076
4% polyformaldehyde	Beyotime Biotechnology	P0099	Cell fixation
50 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	8081	Put keloid tissue
Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG	Abcam	Alexa Fluor 555	second antibody for immunofluorescence staining assay
Anti human CD90	BioLegend	B301002	Identify the purity of fibroblasts
Antibody diluent	Beyotime Biotechnology	P0262
Biological safety cabinet	Thermo Scientific	1300 series A2	Isolation and culture cells
Bovine serum albumin	aladdin	B265993	Blocking for immunofluorescence staining assay
Carbon dioxide incubator	ESCO	CCL-170B-8	Using for culturing cells
Cell cryotubes	Corning	43513	Store the cells in low temperature
centrifugal machine	Thermo Fisher	ST 16R	Discard supernatant
DAPI	Beyotime Biotechnology	C1006	Stain the cellular nucleus
DMSO	MP Biomedicals	196055	Using for preserving cells
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco	C11995500BT	Culture medium solution
Fetal bovine serum	BI	04-001-1A
Flow cytometer	BD	BD FACSCelesta	Observing the identity of cells
frozen box	Thermo Scientific	5100-0050
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2
Laser confocal microscope	Nikon	AIR-HD25	Observing the immunofluorescence staining assay
PDGFR-α antibody	CST	3174T	First antibody for immunofluorescence staining assay
Penicillin-streptomycin-Am solution	Solarbio	P1410	Add in culture medium solution to avoid contamination
petri dish	JETBIOFIL	7556	Culture fibroblasts
Phosphate buffered saline solution	Gibco	C10010500BT	Culture medium solution
Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)	Cell Signaling Technology	5742S	As a control for flow cytometry
Round coverslip	Biosharp	801007	Cell culture
Triton X 100	Solarbio	T8200	Punch holes in the cell membrane
Trypsin-EDTA	Gibco	25200072	Used for passaging cells
Vimentin antibody	Abcam	ab8978	First antibody for immunofluorescence staining assay